抗草甘膦转基因玉米的抗性鉴定、遗传分析及回交转育

发布时间：2017-10-15 08:07

  本文关键词：抗草甘膦转基因玉米的抗性鉴定、遗传分析及回交转育

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【摘要】：玉米作为世界上仅次于水稻和小麦的第三大粮食作物,是非常重要的饲料、工业原料及生物能源。田间的杂草与玉米植株争夺空间、阳光、水分和养分等,并能传播一些病虫害,杂草的危害能使玉米大幅度地减产,严重影响玉米产业的发展。通过转基因方式获得抗除草剂的玉米,可以实现防治杂草的同时,不对农作物造成伤害。但受基因型限制,适合于遗传转化的受体材料有限,转化周期长、转化率低,且通过遗传转化获得的自交系植株的综合性状通常不优良,往往难以直接应用于生产。因此,通过回交的方法将目标基因导入到综合农艺性状优良的背景材料中,获得既具有优良的外源目标基因性状,又综合性状优良的品种是非常必要和重要的。本研究以转入具有自主知识产权的抗草甘膦基因2mg2-epsps的高抗玉米自交系18-599R的T_3代玉米材料为供体,与目前大面积推广或具有应用前景的农艺性状优良的玉米杂交品种亲本SH008、Mo17、R08、R18、RP125和RP128杂交和连续回交。期望获得能稳定遗传的综合性状优良的转基因抗草甘膦玉米,以应用于实际生产中。对F1、BC_1和BC_2代玉米材料(三叶期),田间喷施草甘膦进行表型鉴定,并在BC_1和BC_2代材料喷施草甘膦后,田间统计成活植株数目和枯死植株数目,分析其抗性分离比,对外源基因进行遗传分析。此外,通过PCR.RT-PCR和试纸条检测,分别从DNA水平、转录水平和蛋白质水平对回交后代材料进行分子鉴定。本研究的主要结果如下：1.田间表型鉴定和统计：6个轮回亲本的BC_1和BC_2代材料喷施草甘膦后,抗性分离明显,统计分析结果表明BC_1代材料中SH008不符合1:1的分离比,BC_2代中RP125材料不符合1:1的分离比,其余材料都符合一对显性等位基因控制的孟德尔遗传规律。2.PCR检测结果：BC_1和BC_2代部分材料通过PCR鉴定,均检测到了目的条带。表明通过回交,目的基因导入了受体亲本材料。3.RT-PCR检测及测序结果：对任意选择的三种背景的材料,即SH008、RP125和RP128的BC_1和BC_2代材料PCR检测,并将目的条带回收测序,测序结果与2mG2-epsps基因序列进行比对。结果表明SH008和RP125的BC_1和BC_2代材料PCR扩增的目的序列与2mG2-epsps基因序列一致性为100%,RP128回交后代材料PCR扩增目的序列与2mG2-epsps基因序列一致性为99%。提取序列比对结果一致植株的RNA,进行RT-PCR检测,均检测出目的条带,表明目的基因在回交后代材料中正常转录。4.试纸条检测蛋白结果：试纸条检测6个轮回亲本的部分BC_1和BC_2代材料,首先进行PCR检测,均扩增出目的条带。试纸条检测发现SH008的BC_1、RP128的BC_1和RP128的BC_2代材料未检测到目的蛋白。其它材料均检测到了目的蛋白。未检测到目的蛋白的原因可能是这三个样品中蛋白含量较少,不满足试纸条检测的灵敏度。在后续的实验中,有必要再通过其它方法进行蛋白质水平的鉴定。
【关键词】：抗草甘膦 回交 抗性鉴定 分子检测 分离比
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S513
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 文献综述10-22
• 1.1 草甘膦作用机制10-11
• 1.2 抗除草剂转基因作物研究进展11-13
• 1.3 抗草甘膦转基因玉米研究进展13-14
• 1.4 抗草甘膦转基因作物的安全性14-16
• 1.4.1 抗草甘膦作物的生物安全性14
• 1.4.2 抗草甘膦转基因作物的食用安全性14-16
• 1.5 回交的原理与方法16-17
• 1.6 回交在转基因育种中的应用17
• 1.7 转基因材料的表型鉴定17-18
• 1.8 分子水平鉴定转基因材料18-22
• 1.8.1 选择标记基因与报告基因18
• 1.8.2 PCR法18-19
• 1.8.3 分子杂交19-21
• 1.8.4 酶联免疫分析法ELISA21
• 1.8.5 试纸条检测21-22
• 研究目的和意义22
• 2 材料与方法22-32
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 试验材料22-23
• 2.1.2 主要的试剂、溶液23
• 2.1.3 主要的仪器和设备23
• 2.2 实验方法23-32
• 2.2.1 F_1代材料的获得24-25
• 2.2.2 BC_1代材料的获得25-26
• 2.2.3 BC_2代材料的获得26-28
• 2.2.4 BC_3材料的获得28
• 2.2.5 mRNA水平的检测28-31
• 2.2.6 试纸检测目的蛋白31-32
• 3 结果与分析32-43
• 3.1 F_1抗性鉴定及BC_1材料的获得32-33
• 3.2 BC_1抗性鉴定与田间统计33-34
• 3.2.1 BC_1抗性鉴定33-34
• 3.2.2 BC_1田间统计34
• 3.3 BC_1 PCR检测34-35
• 3.4 BC_2抗性鉴定及田间统计35-36
• 3.4.1 BC_2抗性鉴定35-36
• 3.4.2 BC_2田间统计36
• 3.5 BC_2 PCR检测36-37
• 3.6 回交后代材料mRNA水平的检测37-41
• 3.6.1 PCR检测和测序37-40
• 3.6.2 RNA提取40-41
• 3.6.3 RT-PCR检测41
• 3.7 试纸检测蛋白结果41-43
• 3.7.1 PCR检测41-42
• 3.7.2 试纸条检测目的蛋白42-43
• 4 讨论43-48
• 4.1 草甘膦的喷施浓度43
• 4.2 抗性鉴定及遗传规律43-45
• 4.3 转基因回交后代材料的分子检测方法45-46
• 4.4 回交法获得转基因植株46
• 4.5 回交材料的背景选择46-47
• 4.6 后续试验安排47-48
• 参考文献48-53
• 致谢53

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本文编号：1035992