外源表皮降解蛋白酶基因（Cdep1）转化蜡蚧菌及其酶活性增强效果评价

发布时间：2017-10-13 09:19

  本文关键词：外源表皮降解蛋白酶基因（Cdep1）转化蜡蚧菌及其酶活性增强效果评价

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【摘要】：蜡蚧菌是一种重要的虫生真菌,对于温室害虫具有良好的防治效果,但是由于其作用过程慢、效果容易受环境的影响,所以在实际应用中受到很大的限制。在蜡蚧菌侵染害虫的过程中,其分泌的蛋白酶、几丁质酶等胞外酶具有重要作用。研究发现,增加生防真菌胞外酶的分泌,能显著地提高真菌的毒力水平。本研究从白僵菌中克隆得到一个蛋白酶基因,将其导入蜡蚧菌中,提高蜡蚧菌的蛋白酶分泌水平,以此改良蜡蚧菌菌株。主要研究结果如下:1.克隆外源蛋白酶基因。从一株性状优良的球孢白僵菌中克隆蛋白酶基因Cdep1,根据GenBank中已有的白僵菌蛋白酶基因设计引物,同源克隆得到了白僵菌的蛋白酶基因Cdep1。经Blast比对,其与白僵菌蛋白酶基因(HQ840791)的序列同源性为99%。其对应的氨基酸序列与碱性丝氨酸蛋白酶(KGQ12177)的同源性为99%,其中第128位的氨基酸由丝氨酸突变为酪氨酸,239位氨基酸由缬氨酸突变为丙氨酸。2.构建了Cdep1蛋白酶的真菌表达载体。以质粒pAN7-1为模板,分别克隆得到启动子GdpA、终止子TrpC。采用重叠PCR的方法,结合降落PCR,构建片段GdpA-Cdep1-TrpC(4021bp)。质粒pBht2和连接片段经过Kpn I和HindIII酶切后,使用T4连接酶将该片段与真菌表达质粒pBht2连接,构建了其表达的重组质粒。3.应用了农杆菌转化法和原生质体转化法转化蜡蚧菌。使用重组质粒转化农杆菌感受态,阳性农杆菌在与蜡蚧菌分生孢子共培养2天后转接到抗性平板中,培养至可见单菌落进行验证,结果获得大量的转化子,随机挑选100个转化子做进一步的鉴定。对蜡蚧菌的原生质体转化的条件进行了优化,结果表明蜡蚧菌孢子以1.5×108的浓度接种到土豆液体培养基中,培养24小时,按照1:40的比例加入复配的30mg/mL的裂解液(溶菌酶:纤维素酶:蜗牛酶=2:1:1),酶解3小时,蜡蚧菌的原生质体数量可以达到1.8×107个/g。4.转化子拷贝数鉴定。根据已报道的单拷贝基因EF1α设计扩增内参引物,采用Beacon Designer设计目的基因引物AM-3,使用荧光定量PCR技术,对28个转化子进行拷贝数检测。在消除扩增效率和扩增片段大小的差异后,结果显示转化子中单拷贝的有9株,两拷贝和三拷贝的各有1株。保留单拷贝的菌株用于酶活性评价。5.转化子酶生物活力评价。使用紫外分光光度计,通过对蛋白酶水解酪素产生的酪氨酸含量的测定,检测阳性菌株的蛋白酶活力,结果显示,转化子酶活性最高比出发菌株提高了10倍,具有进一步研究的价值。
【关键词】：蜡蚧菌 蛋白酶基因 遗传转化 拷贝数检测 虫生真菌 生物防治
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S476.12
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-14
• 第一章 引言14-23
• 1.1 蜡蚧菌的侵染过程及其生物防治作用14-18
• 1.1.1 蜡蚧菌致病过程14-15
• 1.1.2 影响蜡蚧菌毒力的主要因子15-17
• 1.1.3 蜡蚧菌在害虫防治中的应用17-18
• 1.2 蜡蚧菌的遗传转化技术18-21
• 1.2.1 遗传转化方法18-19
• 1.2.2 毒力相关基因改良19-20
• 1.2.3 Cdep1蛋白酶基因20
• 1.2.4 转化菌株拷贝数鉴定20-21
• 1.3 研究目的、内容及技术路线21-23
• 1.3.1 研究目的21
• 1.3.2 研究内容21
• 1.3.3 技术路线21-23
• 第二章 目的基因基因克隆23-33
• 2.1 实验材料23-24
• 2.1.1 供试菌株及质粒23
• 2.1.2 主要试剂23
• 2.1.3 常用培养基23
• 2.1.4 常用试剂配制23
• 2.1.5 实验仪器23
• 2.1.6 引物23-24
• 2.2 试验方法24-26
• 2.2.1 菌株DNA提取24
• 2.2.2 菌株ITS鉴定24-25
• 2.2.3 白僵菌RNA提取25
• 2.2.4 cDNA第一链的合成25
• 2.2.5 白僵菌蛋白酶基因克隆25-26
• 2.2.6 pAN7-1 质粒启动子、终止子克隆26
• 2.3 结果与分析26-32
• 2.3.1 菌株鉴定26-27
• 2.3.2 白僵菌总RNA提取与目的基因获得27-31
• 2.3.3 启动子、终止子基因克隆31-32
• 2.4 讨论32-33
• 第三章 表达载体构建以及蜡蚧菌的转化33-45
• 3.1 实验材料33-34
• 3.1.1 供试菌株及质粒33
• 3.1.2 主要试剂33
• 3.1.3 主要培养基33
• 3.1.4 实验仪器33-34
• 3.1.5 引物34
• 3.2 实验方法34-39
• 3.2.1 表达载体构建示意图34
• 3.2.2 目的基因引物设计34-35
• 3.2.3 目的基因的连接35
• 3.2.4 构建重组质粒35-36
• 3.2.5 重组质粒的双酶切验证36
• 3.2.6 农杆菌转化36-37
• 3.2.7 原生质体转化37-39
• 3.3 结果与分析39-44
• 3.3.1 目的片段的连接39
• 3.3.2 重组质粒双酶切鉴定39-40
• 3.3.3 蜡蚧菌菌株鉴定40
• 3.3.4 农杆菌转化鉴定40-41
• 3.3.5 农杆菌转化蜡蚧菌41
• 3.3.6 原生质体制备41-42
• 3.3.7 裂解酶种类对原生质体影响42
• 3.3.8 菌丝培养时间对原生质体的影响42-43
• 3.3.9 酶解时间对原生质体影响43-44
• 3.4 讨论44-45
• 第四章 转化菌株及菌株酶活性变化评价45-54
• 4.1 实验材料45-46
• 4.1.1 供试菌株45
• 4.1.2 主要试剂45
• 4.1.3 主要仪器45
• 4.1.4 培养基及主要试剂配制45
• 4.1.5 引物45-46
• 4.2 试验方法46-47
• 4.2.1 假定转化子单孢分离46
• 4.2.2 转化子DNA验证46
• 4.2.3 遗传稳定性验证46-47
• 4.2.4 转化子拷贝数测定47
• 4.2.5 转化子RNA验证47
• 4.2.6 酶活力测定47
• 4.3 结果与分析47-53
• 4.3.1 转化子DNA验证47-48
• 4.3.2 转化子遗传稳定性检测48
• 4.3.3 目的基因扩增引物选择48-50
• 4.3.4 转化子拷贝数检测50-51
• 4.3.5 转化子RNA检测51-52
• 4.3.6 转化子酶活力比较52-53
• 4.4 讨论53-54
• 第五章 结论与讨论54-56
• 5.1 全文结论54
• 5.2 讨论54-55
• 5.3 创新点55-56
• 参考文献56-63
• 致谢63-64
• 作者简介64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 董汪洋;王郑隆;杨云乔;夏丽丽;王璐;张东旭;柯乐芹;肖建中;;杏鲍菇的菌株筛选与原生质体制备条件优化[J];浙江农业学报;2015年05期

2 方卫国,张永军,马金成,肖月华,杨星勇,裴炎;用YADE法克隆球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的启动子及启动子序列分析[J];菌物系统;2003年02期

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本文编号：1024042