禾谷镰刀菌AREA基因的功能研究

发布时间：2020-07-05 07:54

【摘要】：在酵母和丝状真菌中,氮代谢是受到GATA转录因子Are A/NIT2家族调控的。GATA转录因子的特征是含有一个或两个Cys2/Cys2锌指结构,能够识别目标基因启动子序列中的DNA序列5’-HGATAR-3’(其中H代表A,T,C和R代表A或G)。多数参与氮代谢的结构基因能够被GATA转录因子识别并激活来吸收和利用次级氮源。本研究鉴定了禾谷镰刀菌中GATA转录因子Are A的功能。禾谷镰刀菌的AREA基因缺失突变体Δare A的生长速率减缓且产孢率降低,但分生孢子和菌落边缘形态正常,说明AREA能够影响发育,但对形态并没有影响。有性阶段Δare A敲除突变体子囊壳数量和大小都减少,且不能形成子囊孢子,这说明Are A在调节有性生殖过程中发挥着重要的作用。Δare A突变体对氧化还原增加了敏感性。通过扬花盛期的小麦穗、玉米秆和玉米须侵染实验证明,Δare A突变体的致病性严重降低。通过随机插入带有Are A自身启动子的Are A-GFP融合片段到Δare A突变体中,获得AREA基因互补转化子。互补转化子生长速率、产孢率、子囊壳和子囊孢子形成、DON合成量和致病性等方面都恢复到野生型状态。亚细胞定位实验表明,Are A-GFP信号无论在孢子还是菌丝中都定位在细胞核。我们通过分别缺失Are A蛋白3个潜在的核定位序列,发现NLS3对Are A定位于细胞核以及其它功能都非常重要。Δare A突变体能利用铵态氮和谷氨酰胺等优先氮源,但不能够利用硝态氮、谷氨酸盐等次级氮源,同时也不能诱导硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的表达。实时定量PCR实验也表明铵态氮能够抑制AREA基因的表达,而硝态氮能够诱导AREA基因的表达,表明AREA在禾谷镰刀菌氮代谢中起着正调控的作用。在大米测定真菌毒素DON的实验中,我们发现铵态氮能够抑制野生型中DON的生物合成,但在Δare A突变体中却没有该现象。实时定量PCR实验进一步证明了,即使是在精氨酸诱导产DON的环境中,铵态氮也能够抑制野生型中DON生物合成相关基因TRI5和TRI6的表达,而Δare A突变体中TRI5和TRI6依然是没有下调表达。这说明了铵态氮对DON生物合成基因的抑制作用可能是通过AREA基因来实现的。另外,免疫共沉淀实验证明Are A与Tri10基因互作,进一步证明AREA基因参与了DON生物合成。PKA活性实验和TEY磷酸化实验中,Δare A突变体的PKA活性和Pmk1磷酸化水平降低。点突变Are A蛋白的潜在的PKA磷酸化位点S874,发现其对侵染和Are A蛋白的活性都非常重要。同时,我们发现铵通透酶基因MEP的表达量在Δare A突变体中也显著下调。表明AREA基因可能是通过调节MEP的表达水平而参与c AMP-PKA和MAPK信号通路来进一步调控DON生物合成。综上所述,禾谷镰刀菌GATA转录因子Are A在生长发育,有性生殖,致病性,氮代谢和次生代谢产物DON生物合成过程中都发挥着至关重要的作用。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S432.44

【参考文献】