两种热带作物锈菌LAMP分子检测技术的建立与应用
发布时间：2022-01-20 06:54
植物锈菌病害是危害农业生产的重要病害之一,发病率高,寄主种类多,经济损失大。其中甘蔗黑顶柄锈菌和咖啡驼孢锈菌是危害严重,发生比较普遍的两类专性寄生病原菌,前者引起甘蔗褐锈病,而后者导致咖啡叶锈病,目前针对这两种锈菌还没有非常有效的防治措施,特别是缺乏相关的病害检测技术,因此建立上述两种病菌的快速检测技术对于病害监测与防控具有十分重要的意义。环介导等温扩增方法（LAMP）由于具有高特异性、高灵敏性,以及简便、快速和低成本等特点,已在诸多领域广泛应用。为了建立甘蔗褐锈病菌和咖啡叶锈病菌的LAMP检测技术,本研究进行了如下五个方面的研究。首先,通过对锈菌ITS序列进行比对分析,获得甘蔗褐锈病菌和咖啡叶锈病菌的特异性区域;利用 primer explorer 4.0 软件（http://primer explorer.jp/ela mp4.0.0）对特异性区域进行LAMP引物组设计。进一步通过引物组筛选获得二者最佳引物BRSC4和HVSC2。其次,基于各自最佳引物组,对25 μL LAMP反应体系和反应条件进行了优化。优化后甘蔗褐锈病菌LAMP反应体系各组份为:0.2 μM F3和B3,1.2...
【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
LAMP扩增机制示意.(Notomietal.,2000)
ＢＲＳＣ２－ＢＲＳＣ５则均能扩增出条带。其中由引物ＢＲＳＣ２、ＢＲＳＣ３、ＢＲＳＣ４和ＢＲＳＣ５??扩增反应液均呈绿色，但是它们的凝胶检测结果表明，其中ＢＲＳＣ４引物其梯状条带??较清晰，而其它引物组条带较为弥散暗淡，效果不好（图２．５）。故选取引物ＢＲＳＣ４??进行后续操作。图２．６为引物ＢＲＳＣ４的序列位置设计不意图。??ｍｍ??图２．５甘蔗褐锈病菌ＬＡＭＰ引物筛选??Ｍ：?ＤＬ２０００标准分子量；１：阴性对照；２：引物ＢＲＳＣ１；?３：引物ＢＲＳＣ２；?４：引物ＢＲＳＣ３；?５：??引物ＢＲＳＣ４；?６：弓丨物ＢＲＳＣ５。Ａ，?ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ显色图；Ｂ，琼脂糖凝胶电泳图。??Ｆｉｇ．?２．５?Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｏｆ?ＬＡＭＰ?ｐｒｉｍｅｒ?ｆｏｒ?ｓｕｇａｒｃａｎｅ?Ｐｕｃｃｉｎｉａ?ｍｅｌａｎｏｃｅｐｈａｌａ??Ｍ：?ＤＬ?２?０００?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；?１：?ｄｄＨ２０?ｃｏｎｔｒｏｌ；?２：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ１；?３：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ２；?４：?Ｐｒｉｍｅｒ??ＢＲＳＣ３；?５：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ４；?６：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ５．?Ａ，?ＬＡＭＰ?ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｃａｕｓｉｎｇ?ｃｈａｎｇｅ?ｉｎ?ｃｏｌｏｒ；?Ｂ，?ＬＡＭＰ??ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｅｄ?ｏｎ?２?％?ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ．??１?ＣＡＣＣＴＴＴＴＧＧ?ＴＡＴＴＣＣＡＡＡＡ?ＧＧＴＡＣＡＣＣＴＧ?ＴＴＴＧＡＧＴＧＴＣ?ＡＴＧＡＡＡＡＣＣＴ??＾Ｆ３上游引物??５１?ＣＴＣＡＣＴＡＡＡＡ?ＣＡＡＣＴＴＴＧＴＴ?ＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴ?ＴＴＡＧＴ
ＢＲＳＣ２－ＢＲＳＣ５则均能扩增出条带。其中由引物ＢＲＳＣ２、ＢＲＳＣ３、ＢＲＳＣ４和ＢＲＳＣ５??扩增反应液均呈绿色，但是它们的凝胶检测结果表明，其中ＢＲＳＣ４引物其梯状条带??较清晰，而其它引物组条带较为弥散暗淡，效果不好（图２．５）。故选取引物ＢＲＳＣ４??进行后续操作。图２．６为引物ＢＲＳＣ４的序列位置设计不意图。??ｍｍ??图２．５甘蔗褐锈病菌ＬＡＭＰ引物筛选??Ｍ：?ＤＬ２０００标准分子量；１：阴性对照；２：引物ＢＲＳＣ１；?３：引物ＢＲＳＣ２；?４：引物ＢＲＳＣ３；?５：??引物ＢＲＳＣ４；?６：弓丨物ＢＲＳＣ５。Ａ，?ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ显色图；Ｂ，琼脂糖凝胶电泳图。??Ｆｉｇ．?２．５?Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｏｆ?ＬＡＭＰ?ｐｒｉｍｅｒ?ｆｏｒ?ｓｕｇａｒｃａｎｅ?Ｐｕｃｃｉｎｉａ?ｍｅｌａｎｏｃｅｐｈａｌａ??Ｍ：?ＤＬ?２?０００?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；?１：?ｄｄＨ２０?ｃｏｎｔｒｏｌ；?２：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ１；?３：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ２；?４：?Ｐｒｉｍｅｒ??ＢＲＳＣ３；?５：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ４；?６：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ５．?Ａ，?ＬＡＭＰ?ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｃａｕｓｉｎｇ?ｃｈａｎｇｅ?ｉｎ?ｃｏｌｏｒ；?Ｂ，?ＬＡＭＰ??ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｅｄ?ｏｎ?２?％?ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ．??１?ＣＡＣＣＴＴＴＴＧＧ?ＴＡＴＴＣＣＡＡＡＡ?ＧＧＴＡＣＡＣＣＴＧ?ＴＴＴＧＡＧＴＧＴＣ?ＡＴＧＡＡＡＡＣＣＴ??＾Ｆ３上游引物??５１?ＣＴＣＡＣＴＡＡＡＡ?ＣＡＡＣＴＴＴＧＴＴ?ＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴ?ＴＴＡＧＴ
【参考文献】：
期刊论文
[1]中国甘蔗产业支持政策及相关发展思路[J]. 王学清,张静. 农业展望. 2018(01)
[2]甘蔗褐锈病菌巢式PCR分子检测方法的建立[J]. 汪涵,吴伟怀,杨旭光,杨先锋,李锐,郑金龙,黄兴,梁艳琼,贺春萍,易克贤. 热带作物学报. 2017(12)
[3]沙门菌LAMP检测方法的建立[J]. 李迎晓,焦凤超,赵瑜,刘锦妮,李洵,吴海港,曲哲会,易本驰. 畜牧与兽医. 2017(12)
[4]咖啡驼孢锈菌PCR分子检测体系的建立[J]. 汪涵,吴伟怀,李乐,梁艳琼,郑金龙,习金根,李锐,黄兴,贺春萍,易克贤. 热带作物学报. 2017(09)
[5]植物病原真菌分子检测技术的研究进展[J]. 彭丹丹,张源明,舒灿伟,周而勋. 基因组学与应用生物学. 2017(05)
[6]甘蔗重要病害分子检测技术[J]. 李文凤,王晓燕,黄应昆,单红丽,张荣跃,尹炯,罗志明. 植物保护. 2016(05)
[7]植物青枯菌LAMP检测方法的建立[J]. 黄雯,徐进,张昊,许景升,丁伟,冯洁. 中国农业科学. 2016(11)
[8]我国甘蔗锈病病原菌及甘蔗品系抗褐锈病基因Bru1的分子检测[J]. 傅华英,肖胜华,刘营航,孙生仁,吴小斌,陈如凯,高三基. 热带作物学报. 2016(05)
[9]不同引物PCR检测向日葵黑茎病菌的灵敏度比较及应用[J]. 张娜,乾义柯,尚爽,陆平,易建平. 植物保护学报. 2015(05)
[10]甘蔗宿根矮化病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 王恒波,陈平华,高三基,郭晋隆,陈如凯. 植物病理学报. 2015(03)
博士论文
[1]基于环介导等温扩增技术快速诊断大豆根部主要病害的研究[D]. 陆辰晨.南京农业大学 2015
硕士论文
[1]LAMP与SYBR GREEN I实时荧光定量PCR方法检测酸奶中葡糖杆菌的研究[D]. 李月华.河北农业大学 2015
[2]大豆茎部病原菌环介导等温扩增技术快速检测的研究[D]. 沈浩.南京农业大学 2015
[3]广东甘蔗产业链优化研究[D]. 傅明其.海南大学 2013
[4]食源性致病菌阪崎肠杆菌和痢疾志贺菌LAMP快速检测技术的建立与初步应用[D]. 曾桂芬.南方医科大学 2012
[5]小麦叶片上潜伏期条锈菌的巢式PCR检测及小麦与条锈菌互作中相关激酶类基因的表达谱分析[D]. 汤春蕾.西北农林科技大学 2008
[6]苹果蠹蛾Cydia pomonella （L.）在中国的适生性研究[D]. 杨瑞.西北农林科技大学 2008
[7]LAMP法检测金黄色葡萄球菌[D]. 陈妍.天津大学 2007
本文编号：3598371
【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
LAMP扩增机制示意.(Notomietal.,2000)
ＢＲＳＣ２－ＢＲＳＣ５则均能扩增出条带。其中由引物ＢＲＳＣ２、ＢＲＳＣ３、ＢＲＳＣ４和ＢＲＳＣ５??扩增反应液均呈绿色，但是它们的凝胶检测结果表明，其中ＢＲＳＣ４引物其梯状条带??较清晰，而其它引物组条带较为弥散暗淡，效果不好（图２．５）。故选取引物ＢＲＳＣ４??进行后续操作。图２．６为引物ＢＲＳＣ４的序列位置设计不意图。??ｍｍ??图２．５甘蔗褐锈病菌ＬＡＭＰ引物筛选??Ｍ：?ＤＬ２０００标准分子量；１：阴性对照；２：引物ＢＲＳＣ１；?３：引物ＢＲＳＣ２；?４：引物ＢＲＳＣ３；?５：??引物ＢＲＳＣ４；?６：弓丨物ＢＲＳＣ５。Ａ，?ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ显色图；Ｂ，琼脂糖凝胶电泳图。??Ｆｉｇ．?２．５?Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｏｆ?ＬＡＭＰ?ｐｒｉｍｅｒ?ｆｏｒ?ｓｕｇａｒｃａｎｅ?Ｐｕｃｃｉｎｉａ?ｍｅｌａｎｏｃｅｐｈａｌａ??Ｍ：?ＤＬ?２?０００?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；?１：?ｄｄＨ２０?ｃｏｎｔｒｏｌ；?２：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ１；?３：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ２；?４：?Ｐｒｉｍｅｒ??ＢＲＳＣ３；?５：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ４；?６：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ５．?Ａ，?ＬＡＭＰ?ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｃａｕｓｉｎｇ?ｃｈａｎｇｅ?ｉｎ?ｃｏｌｏｒ；?Ｂ，?ＬＡＭＰ??ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｅｄ?ｏｎ?２?％?ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ．??１?ＣＡＣＣＴＴＴＴＧＧ?ＴＡＴＴＣＣＡＡＡＡ?ＧＧＴＡＣＡＣＣＴＧ?ＴＴＴＧＡＧＴＧＴＣ?ＡＴＧＡＡＡＡＣＣＴ??＾Ｆ３上游引物??５１?ＣＴＣＡＣＴＡＡＡＡ?ＣＡＡＣＴＴＴＧＴＴ?ＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴ?ＴＴＡＧＴ
ＢＲＳＣ２－ＢＲＳＣ５则均能扩增出条带。其中由引物ＢＲＳＣ２、ＢＲＳＣ３、ＢＲＳＣ４和ＢＲＳＣ５??扩增反应液均呈绿色，但是它们的凝胶检测结果表明，其中ＢＲＳＣ４引物其梯状条带??较清晰，而其它引物组条带较为弥散暗淡，效果不好（图２．５）。故选取引物ＢＲＳＣ４??进行后续操作。图２．６为引物ＢＲＳＣ４的序列位置设计不意图。??ｍｍ??图２．５甘蔗褐锈病菌ＬＡＭＰ引物筛选??Ｍ：?ＤＬ２０００标准分子量；１：阴性对照；２：引物ＢＲＳＣ１；?３：引物ＢＲＳＣ２；?４：引物ＢＲＳＣ３；?５：??引物ＢＲＳＣ４；?６：弓丨物ＢＲＳＣ５。Ａ，?ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ显色图；Ｂ，琼脂糖凝胶电泳图。??Ｆｉｇ．?２．５?Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｏｆ?ＬＡＭＰ?ｐｒｉｍｅｒ?ｆｏｒ?ｓｕｇａｒｃａｎｅ?Ｐｕｃｃｉｎｉａ?ｍｅｌａｎｏｃｅｐｈａｌａ??Ｍ：?ＤＬ?２?０００?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；?１：?ｄｄＨ２０?ｃｏｎｔｒｏｌ；?２：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ１；?３：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ２；?４：?Ｐｒｉｍｅｒ??ＢＲＳＣ３；?５：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ４；?６：?Ｐｒｉｍｅｒ?ＢＲＳＣ５．?Ａ，?ＬＡＭＰ?ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｃａｕｓｉｎｇ?ｃｈａｎｇｅ?ｉｎ?ｃｏｌｏｒ；?Ｂ，?ＬＡＭＰ??ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｅｄ?ｏｎ?２?％?ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ．??１?ＣＡＣＣＴＴＴＴＧＧ?ＴＡＴＴＣＣＡＡＡＡ?ＧＧＴＡＣＡＣＣＴＧ?ＴＴＴＧＡＧＴＧＴＣ?ＡＴＧＡＡＡＡＣＣＴ??＾Ｆ３上游引物??５１?ＣＴＣＡＣＴＡＡＡＡ?ＣＡＡＣＴＴＴＧＴＴ?ＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴ?ＴＴＡＧＴ
【参考文献】：
期刊论文
[1]中国甘蔗产业支持政策及相关发展思路[J]. 王学清,张静. 农业展望. 2018(01)
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[4]咖啡驼孢锈菌PCR分子检测体系的建立[J]. 汪涵,吴伟怀,李乐,梁艳琼,郑金龙,习金根,李锐,黄兴,贺春萍,易克贤. 热带作物学报. 2017(09)
[5]植物病原真菌分子检测技术的研究进展[J]. 彭丹丹,张源明,舒灿伟,周而勋. 基因组学与应用生物学. 2017(05)
[6]甘蔗重要病害分子检测技术[J]. 李文凤,王晓燕,黄应昆,单红丽,张荣跃,尹炯,罗志明. 植物保护. 2016(05)
[7]植物青枯菌LAMP检测方法的建立[J]. 黄雯,徐进,张昊,许景升,丁伟,冯洁. 中国农业科学. 2016(11)
[8]我国甘蔗锈病病原菌及甘蔗品系抗褐锈病基因Bru1的分子检测[J]. 傅华英,肖胜华,刘营航,孙生仁,吴小斌,陈如凯,高三基. 热带作物学报. 2016(05)
[9]不同引物PCR检测向日葵黑茎病菌的灵敏度比较及应用[J]. 张娜,乾义柯,尚爽,陆平,易建平. 植物保护学报. 2015(05)
[10]甘蔗宿根矮化病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 王恒波,陈平华,高三基,郭晋隆,陈如凯. 植物病理学报. 2015(03)
博士论文
[1]基于环介导等温扩增技术快速诊断大豆根部主要病害的研究[D]. 陆辰晨.南京农业大学 2015
硕士论文
[1]LAMP与SYBR GREEN I实时荧光定量PCR方法检测酸奶中葡糖杆菌的研究[D]. 李月华.河北农业大学 2015
[2]大豆茎部病原菌环介导等温扩增技术快速检测的研究[D]. 沈浩.南京农业大学 2015
[3]广东甘蔗产业链优化研究[D]. 傅明其.海南大学 2013
[4]食源性致病菌阪崎肠杆菌和痢疾志贺菌LAMP快速检测技术的建立与初步应用[D]. 曾桂芬.南方医科大学 2012
[5]小麦叶片上潜伏期条锈菌的巢式PCR检测及小麦与条锈菌互作中相关激酶类基因的表达谱分析[D]. 汤春蕾.西北农林科技大学 2008
[6]苹果蠹蛾Cydia pomonella （L.）在中国的适生性研究[D]. 杨瑞.西北农林科技大学 2008
[7]LAMP法检测金黄色葡萄球菌[D]. 陈妍.天津大学 2007
本文编号：3598371
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