寄主植物对甜菜夜蛾免疫核型多角体病毒的影响及机理

发布时间：2020-05-25 13:32

【摘要】：国内外研究发现,寄主植物可调控植食性昆虫对病毒的易感性,但导致这种易感性差异的机理尚不明确。因此本研究以植物(黄豆、甘蓝和蕹菜)、(甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和甜菜夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera exigua multicapsid nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)为研究对象,运用生态学、生理以及分子技术手段,试图揭示植物调控植食性昆虫对病毒的易感性差异的机理。主要结果如下:1.取食不同寄主植物的甜菜夜蛾,在感染病毒后的12h、24h、36h、48h、72h等5个时间点,血淋巴中病毒增殖和血淋巴黑化率有明显差异。取食不同食物的幼虫在感毒处理后病毒增殖量大小依次为:黄豆人工饲料甘蓝蕹菜,病毒增值数量随着感毒后时间的延长呈指数上升;取食蕹菜和甘蓝的幼虫血淋巴黑化率显著高于取食黄豆的幼虫。黑化率与病毒增殖量可用指数关系模型拟合,感毒幼虫的血淋巴黑化率与病毒的增殖量呈负相关关系,即血淋巴黑化率随病毒增殖量的增加而降低。表明不同寄主植物可能影响了宿主的黑化反应而导致血淋巴中病毒增殖量的不同。2.为探明黑化水平差异的机理,测定了黑化反应关键酶(酚氧化酶(phenoloxidase,PO)、多巴脱羧酶(Dopa decarboxylase,DDC)和酪氨酸羟化酶(tyrosine 3-monooxygenase,TH))的活性。未感病甜菜夜蛾幼虫取食4种食物后,其血淋巴多巴脱羧酶、酚氧化酶和酪氨酸羟化酶活性有显著差异,且随着时间延长,三种酶活性均表现出上升的趋势。感毒处理组中,取食蕹菜的幼虫血淋巴中酚氧化酶活性最高,黄豆最低,人工饲料和甘蓝次之,多巴脱羧酶和酪氨酸羟化酶活性也有相同现象。相关性分析表明,黑化反应关键酶活性与黑化率呈正相关关系,与病毒增殖量呈现负相关。表明多巴脱羧酶、酚氧化酶和酪氨酸羟化酶协同参与甜菜夜蛾的黑化反应,取食蕹菜和甘蓝的幼虫通过体液免疫抗病毒的能力高于黄豆。3.在测定酶活性的基础上,进一步测定了黑化反应关键酶(酚氧化酶、多巴脱羧酶和酪氨酸羟化酶)基因的转录水平。取食不同食物的甜菜夜蛾幼虫感毒处理后三种酶的基因表达量变化趋势与酶活性基本一致,均是先升高后降低。感毒处理组多巴脱羧酶、酚氧化酶和酪氨酸羟化酶活性,均是蕹菜处理最高,人工饲料和甘蓝次之,黄豆最低。各感毒处理组酚氧化酶基因相对表达量在24h最高,而多巴脱羧酶和酪氨酸羟化酶两种酶的基因相对表达量在36h最高,且各处理组中差异显著;取食蕹菜的幼虫在感毒后12-72h的多巴脱羧酶、酚氧化酶和酪氨酸羟化酶基因表达量均显著高于取食黄豆;说明寄主植物可能通过调控感毒幼虫体内黑化反应关键酶的基因表达量影响了酶的活性。4.从细胞免疫入手,探究寄主植物对甜菜夜蛾感染核型多角体病毒后细胞凋亡的影响。结果表明,取食4种食物的未感毒宿主幼虫的细胞凋亡率均较低,但感染病毒后的宿主细胞凋亡率迅速升高,且在同一种食物上的不同时间点的凋亡率差异性极显著,同一时间点的四种食物处理间亦存在显著性差异,均表现为蕹菜和甘蓝处理组细胞凋亡率显著大于黄豆和人工饲料处理。说明取食蕹菜和甘蓝的幼虫其细胞免疫力高于黄豆。幼虫血细胞凋亡率与体内病毒的相对增殖量呈正相关关系,可用指数关系模型较好地拟合。5.取食4种食物的甜菜夜蛾幼虫感染病毒后12-72h,促使细胞发生凋亡的甜菜夜蛾半胱天冬酶(caspase)基因相对表达量显著上升,细胞凋亡抑制子(Inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)基因相对表达量下降。取食蕹菜和甘蓝组,半胱天冬酶基因表达量显著高于黄豆和人工饲料;取食黄豆的宿主凋亡抑制子基因相对表达量高于蕹菜与甘蓝。细胞凋亡率与半胱天冬酶基因的表达量呈正相关关系,与甜菜夜蛾细胞凋亡抑制子(Se-IAP)基因相对表达量呈负相关关系,说明寄主植物调控甜菜夜蛾半胱天冬酶和凋亡抑制子基因表达在参与甜菜夜蛾细胞凋亡反应中有着重要作用。研究结果为探究寄主植物影响感毒幼虫细胞凋亡的分子机制提供了参考。本研究证实,感毒和寄主植物的互作显著影响甜菜夜蛾幼虫体内甜菜夜蛾核型多角体病毒的增殖、黑化反应和细胞凋亡。研究结果从宿主免疫角度解析了植物调控植食性昆虫对病毒的易感性机理,为植物、昆虫和病毒相互作用的关系研究积累了思路与方法。
【图文】：

图 3-2 基因的扩增曲线Figure 3-2 The amplification curve of (Se-PPO、Se-DDC 和 Se-TH)genes注：a: Se-β-actin 基因的扩增曲线；b: Se-PPO基因的扩增曲线；c: Se-DDC 基因的扩增曲线；d: Se-TH 基因的扩增曲线.Note: a: The amplification curve of Se-β-actin gene; b: The amplification curve of Se-PPO gene;c: The amplification curve of Se-DDC gene; d: The amplification curve of Se-TH gene.目的基因（Se-PPO、Se-DDC 和 Se-TH）和内参基因（Se-β-actin）的扩增曲线倾斜程度基本一致，扩增效率较高（图 3-2）。基因的熔解曲线为单峰，且Se-PPO、Se-DDC 和 Se-TH 基因的溶解曲线 Tm 值在各目的片段 Tm 值范围内，说明产物单一，，无引物二聚体（图 3-3）。该结果表明了引物特异性强，可进行荧光定量分析。

23图 3-3 基因的熔解曲线Figure 3-3 The melt curve of (Se-PPO、Se-DDC 和 Se-TH)genes注：a: Se-β-actin 基因的熔解曲线；b: Se-PPO基因的熔解曲线；c: Se-DDC 基因的熔解曲线；d: Se-TH 基因的熔解曲线.Note: a: The melt curve of Se-β-actin gene; b: The melt curve of Se-PPO gene;c: The melt curve of Se-DDC gene; d: The melt curve of Se-TH gene;PO、DDC 和 TH 三种酶活性和相应的基因表达量的指数关系模型表明：血中 PO、DDC 和 TH 三种酶活性与相应的基因表达量呈正相关关系，酶活性应基因表达量的上升而上升( 图 3-3 ) 。甜菜夜蛾幼虫的血淋巴黑化率与 DDC、PO和 TH三种酶活性和基因表达量指数关系模型表明，感毒幼虫的血淋巴黑化率随着多巴脱羧酶、酚氧化酶、酪酸羟化酶活性和相应的基因表达量的上升而上升 ( 图 3-4 )。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S476;S433.4

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本文编号：2680227