花楸烂皮病病原菌鉴定及其拮抗菌的筛选

发布时间：2020-05-26 12:33

【摘要】：本文对东北林业大学校园内的花楸病害进行标本采集,病原菌的分离、纯化、鉴定、接种试验和再分离,确定该病害为花楸烂皮病并鉴定其致病病原菌。对病原菌的生物生态学特性进行了研究;以校园内花楸3～5年生枝条的树皮内生真菌的群落组成为基础,通过平板对峙实验筛选出具有开发利用潜能的拮抗菌株,为花楸烂皮病的生物防治打下了基础。主要研究结果如下:1、通过对东北林业大学校园内花楸树的发病情况调查,确定了花楸烂皮病具有较强的致病性。通过柯赫氏法则接种验证,确定了花楸烂皮病的致病病原菌,以形态学和分子生物学相结合的方法,对花楸烂皮病的病原菌进行了鉴定,确定其无性型为核果壳囊孢[Cytosporaleucostoma(Speg.)Sacc.],有性型为白孔座壳菌[Leucostoma persoonii(Nitschke)Hohn.],该病害为花楸上的新病害。2、通过对病原菌生物生态学特性的研究,得出该病原菌核果壳囊孢[Cytospora leucostoma(Speg.)Sacc.],最适生长温度为23℃;对酸碱度适应能力较强,在pH值为4.5～9.2的范围内均能生长,但在pH值为6.2时菌丝生长最为迅速;病原菌在以淀粉为碳源的培养基上生长最好,以蛋白胨为氮源的培养基上生长最快;在全光照的条件下菌丝生长最快;在半光照的条件下更易产生分生孢子器及分生孢子;在变温条件下病原菌易产分生孢子器和分生孢子;在15℃条件下孢子萌发率最大;湿度越大孢子萌发率越高,在相对湿度100%(即水滴中)萌发率最大。3、通过对花楸3～5年生枝条树皮内生真菌群落的研究,得出树皮真菌的种类较丰富,共分离出13属(种)真菌,其中,12属(种)为半知菌,1种为接合菌。其中优势种为Paecilomyces sp.、Penicillium sp.、Trichoderma longibrachiatum Trichoderma harzianum,分离率为 16.8%、21.3%、13.0%和 12.7%。4、在选出的6种真菌与病原菌的平板对峙试验中,长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)对病原菌菌丝的抑制效果最强,抑制率为70.34%,其次为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、绿色木霉(Trichoderma virida,抑制率分别为 49.58%和46.52%,这三种真菌对病原菌的抑制率均能达到40%以上。根据对病原菌的抑菌率、拮抗系数和被覆盖的程度等指标,最终筛选出可以有效抑制花楸烂皮病病原菌的拮抗菌株为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)和绿色木霉(Trichoderma viride)。5、三种生防菌的发酵液对花楸烂皮病原菌菌丝生长和孢子萌发抑制作用差别均较大,对菌丝抑制率最高的是T-2哈茨木霉(Trichoderma harzianum),在发酵液含量为50%时抑制率为70.21%。对孢子萌发抑制作用最强的是T-1长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum),24h时萌发率被抑制在58%以下。
【图文】：

测序后得到的ＰＣＲ产物５９４ｂｐ，通过与ＮＣＢＩ数据库进行结果比对，与核果壳囊孢逡逑／ｅｗｃ0５ｆ0ＯＴａ邋（登录号：ＫＹ９７７５３５．１）相比较覆盖度９９邋％，同源性１００邋％。通逡逑过Ｍａｇｅ５．０构建系统发育树如图２－３，邋ＨＧＢ３５与Ｃ邋／ｅｗｃｏ＾ｏｍａ处于同一分枝上。逡逑＞ＨＧＢ３５病原菌ＩＴＳ基因序列逡逑ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＧＴＴＧＧＴＧＡＡＣＣＡＧＣＧＧＡＧＧＧＡＴＣＡＴＴＧＣＴ逡逑ＧＧＡＡＧＣＧＣＣＧＣＡＡＧＧＴＧＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＣＣＣＴＴＴＧＴＧＡＡＣＴＴＡＴＡＣＣＴＡＴＡＴＣＧＴＴＧＣ逡逑ＣＴＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＣＣＣＧＣＣＴＣＴＧＧＴＣＧＴＡＡＡＡＡＧＣ逡逑ＣＡＧＧＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＧＣＣＧＧＴＧＧＣＣＴＡＣＴＡＡＡＣＴＣＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＡＧＴＡ逡逑ＡＡＡＴＣＴＧＡＧＴＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＣＡＡＣＧＧＡＴＣＴＣＴＴＧＧＴＴＣＴ逡逑ＧＧＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＧＣＧＡＡＡＴＧＣＧＡＴＡＡＧＴＡＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＡＧ逡逑－１４－逡逑

明该菌对无机氮利用率不高，但是无氮条件下菌丝更为稀疏。再次为凡《４＞＾０３和逡逑（ＮＨ４）２Ｓ０４，最次为ＮａＮ０３，说明该菌对以ＮＨ４形态下存在的氮元素的利用率要比在逡逑Ｎ０３Ｂ态下存在的氮元素利用率高。生长曲线见图３－４：逡逑１．５－１逡逑Ｔ逡逑Ｑ邋１．０－逦■邋Ｔ逡逑Ｅ逦丁逡逑0逦丁逦Ｉ—．咖．—逡逑Ｖ－／逦１逡逑—ｐ＊逦逦逦邋＇邋＇逦？人Ｖ逦Ｖ邋■＇逡逑．．．．．．．逡逑■邋■邋逦逡逑０邋５－逡逑？ｊ邋＾逦？逦．．．逡逑00邋蛋白胨逦ＮａＮＣｈ逦ＮＨｉＮＯ＾邋（ＮＨＯ２ＳＯ１邋无氮逡逑图３－４不同l#源对病原菌伣菌丝的影响逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－４邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｎｉｔｒｏｇｅｎ邋ｓｏｕｒｃｅｓ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｍｙｃｅｌｉａ邋ｏｆ邋Ｃｙｔｏｓｐｏｒａ邋ｌｅｕｃｏｓｔｏｍａ逡逑３．３．４不同培养基对病原菌菌丝生长的影响逡逑菌丝在大部分的培养基上均能生长，其中在ＰＤＡ上病原菌的菌丝生长最快，菌落逡逑致密，其次是ＳＤＡ培养基，在这两种培养基上菌丝密且厚；在玉米粉培养基〔ＰＳＡ培逡逑养基和查彼培养基上菌丝生长较稀疏，，只长表面一层。生长曲线见图３－５：逡逑１．２－，逡逑丁逡逑￣ｒ￣逡逑０．９－逡逑Ｘ－Ｖ逡逑Ｅ逦－－Ｉ－丁逡逑Ｕ逦丁逡逑０．６－逡逑ｍ逡逑人丨０．３＿逡逑０．０－１—Ｉ逦１逦＊逦逦１——————ｒ逦逦逦１逦逦逦．逦逡逑玉米粉逦查彼逦ＰＳＡ逦ＰＤＡ逦ＳＤＡ逡逑培养基类型逡逑图３－５不同培养基对病原菌菌丝的影响逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－５邋Ｅｆｆ
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S763.7

【参考文献】

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本文编号：2681839