莱氏野村菌Nrsod1和Nrsod2基因的克隆与功能研究

发布时间：2023-04-19 20:02

　　莱氏野村菌(Nomuraea rileyi=Metarhizium rileyi)是全世界广泛分布的环境友好型生物防治真菌,主要侵染夜蛾科的害虫。其分生孢子是真菌杀虫剂的有效成分,但分生孢子在常规的真菌培养基上产孢量低、且需要光照等因素限制了该菌的规模化生产和商业化应用。本实验室通过液体发酵成功诱导出莱氏野村菌微菌核(王中康,2012,ZL2011103033145),微菌核(microsclerotium,MS)是在特定条件下由菌丝的大量聚集缠绕特化形成的一种休眠繁殖体结构,其作为害虫生防接种体,萌发生长过程快、抗逆性强、货架期长、稳定性高等优良特性,为新的莱氏野村菌杀虫制剂的创制提供了全新的来源。前期实验室工作已经证实,微菌核的形成是一种氧化胁迫的过程,微菌核的形成伴随着色素的沉淀、活性氧(ROS)的大量产生以及大量氧化胁迫相关基因的上调表达,对这一调控通路的研究可为开发高毒力的莱氏野村菌生防制剂提供重要的理论依据。本实验从已建立的N.rileyi转录组文库中筛选出与微菌核诱导形成相关的两个上调表达的Cu/Zn-sod基因,分别命名为Nrsod1和Nrsod2,并通过基因敲除的方法...

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1 绪论
    1.1 引言
    1.2 研究背景
        1.2.1 莱氏野村菌概况
        1.2.2 微菌核研究进展
        1.2.3 生防真菌抗逆生物学
        1.2.4 sod基因的研究进展
    1.3 研究目的
    1.4 研究内容
    1.5 技术路线
    1.6 本研究的创新之处
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株和载体
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器设备
    2.2 研究方法
        2.2.1 菌种活化与孢悬液的制备
        2.2.2 微菌核的诱导培养
        2.2.3 莱氏野村菌基因组DNA的提取
        2.2.4 莱氏野村菌RNA提取及反转录
        2.2.5 Nrsod1和Nrsod2基因的克隆
        2.2.6 Nrsod1和Nrsod2左右臂序列的扩增
        2.2.7 Nrsod1和Nrsod2基因生物信息学分析
        2.2.8 大肠杆菌感受态细胞制备与转化
        2.2.9 农杆菌感受态细胞制备与转化
        2.2.10 Nrsod1和Nrsod2基因敲除载体构建
        2.2.11 农杆菌介导的莱氏野村菌遗传转化
        2.2.12 突变体初步筛选
        2.2.13 敲除突变株表型分析
        2.2.14 实时荧光定量PCR
        2.2.15 毒力测定
        2.2.16 数据统计及显著性分析
3 结果与分析
    3.1 Nrsod1和Nrsod2基因克隆与分析
        3.1.1 Nrsod1和Nrsod2基因克隆
        3.1.2 Nrsod1和Nrsod2基因生物信息学分析
        3.1.3 同源比对及系统进化分析
    3.2 敲除载体构建与突变菌株筛选验证
        3.2.1 敲除载体构建
        3.2.2 突变菌株筛选验证
    3.3 基因敲除对莱氏野村菌性状及功能的影响
        3.3.1 莱氏野村菌在培养条件下生长发育基本情况分析
        3.3.2 胁迫条件下菌株表型分析
        3.3.3 △Nrsod1和△Nrsod2基因对微菌核形成的影响
        3.3.4 Nrsod1和Nrsod2基因表达模式分析
    3.4 Nrsod1和Nrsod2基因对毒力的影响分析
4 讨论
5 主要结论与后续工作
    5.1 主要研究结论
    5.2 后续工作建议
致谢
附件
参考文献
附录
    A. 作者在攻读硕士学位期间发表论文目录
    B. 作者在攻读硕士学位期间参与科研项目



本文编号：3794126