响应大豆胞囊线虫胁迫的GmMIPS基因的表达分析及亚细胞定位的研究

发布时间：2023-11-12 18:43

　　大豆作为我国的主要农作物,长年受到生物或非生物胁迫,前人关于盐碱、干旱等非生物胁迫已有颇多的报道,但有关生物胁迫的研究较少。大豆胞囊线虫(Soybean Cyst Nematode,简称:SCN)病是主要生物胁迫病害之一,侵染植株严重。因此,如何防治SCN已逐渐成为科学家研究的重点。传统的防治方法为轮作或者种植抗病品种,但传统方法容易导致线虫产生适应性,因此随着基因工程技术的发展,筛选抗性基因并培育抗性植株成为主要防治手段并取得成效。肌醇磷酸合成酶(MIPS)催化葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)生成肌醇-1-磷酸,此步骤为真核生物肌醇合成的限速步骤。肌醇参与植物体中多种代谢途径,并且与植物细胞壁的生物合成密切相关,肌醇可以通过自身氧化代谢途径生成参与细胞壁合成的多糖:木聚糖以及果胶。由此推断,调控MIPS基因的表达水平可增强大豆细胞壁的合成用于抵抗线虫的侵染。在大豆基因组上发现MIPS基因,命名为GmMIPS,其基因家族包括四个基因。本试验选择抗病品种灰皮支黑豆、哈尔滨小黑豆、小粒黑豆以及感病品种辽豆15,分别在SCN三号生理小种(SCN3)侵染后的不同时间段取样,提取RNA并反转录为c...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 大豆胞囊线虫简介
        1.1.1 大豆胞囊线虫的生活史
        1.1.2 大豆胞囊线虫线虫病的危害
        1.1.3 大豆胞囊线虫的防治
        1.1.4 大豆胞囊线虫病的抗性机制研究进展
    1.2 肌醇磷酸合成酶(MIPS)简介
    1.3 肌醇磷酸合成酶基因(MIPS)的简介
        1.3.1 MIPS基因在线虫胁迫下的研究
        1.3.2 MIPS基因在非生物胁迫下的研究
    1.4 本课题的主要思路及研究内容
第二章 Gm MIPS1、Gm MIPS2蛋白的生物信息学分析
    2.1 生物信息学分析网址及工具软件
    2.2 结果与分析
        2.2.1 Gm MIPS1和Gm MIPS2基因的序列分析
        2.2.2 Gm MIPS1和Gm MIPS2蛋白质的理化性质及二级结构分析
        2.2.3 Gm MIPS1和Gm MIPS2蛋白磷酸化位点分析
        2.2.4 Gm MIPS1和Gm MIPS2蛋白亲水性分析
        2.2.5 Gm MIPS1和Gm MIPS2蛋白的进化分析
    2.3 本章小结
第三章 Gm MIPS1、Gm MIPS2基因在线虫胁迫下的表达分析
    3.1 材料
        3.1.1 植株材料
        3.1.2 大豆胞囊线虫
        3.1.3 试验试剂
        3.1.4 试验设备
    3.2 试验方法
        3.2.1 大豆胞囊线虫的获得和处理
        3.2.2 大豆胞囊线虫的孵育
        3.2.3 供试大豆的处理
        3.2.4 次氯酸钠-酸性品红染色
        3.2.5 大豆根部RNA的提取
        3.2.6 RNA浓度和纯度的检测
        3.2.7 RT-PCR获得c DNA
        3.2.8 Gm MIPS基因荧光定量PCR引物设计
        3.2.9 实时荧光定量PCR操作步骤
    3.3 结果与分析
        3.3.1 SCN3侵染大豆根部后的形态学观察-酸性品红染色结果
        3.3.2 大豆根RNA的提取
        3.3.3 Gm MIPS1和Gm MIPS2基因表达曲线的分析
    3.4 本章小结
第四章 Gm MIPS1、Gm MIPS2基因的克隆和载体构建
    4.1 材料
        4.1.1 植株材料
        4.1.2 供试试剂
        4.1.3 培养基
        4.1.4 试验设备
    4.2 方法
        4.2.1 引物及酶切位点设计
        4.2.2 引物处理和稀释
        4.2.3 大豆总RNA的提取
        4.2.4 RNA浓度和纯度检测
        4.2.5 反转录c DNA
        4.2.6 Gm MIPS1和Gm MIPS2基因扩增
        4.2.7 PCR产物的纯化
        4.2.8 目的基因的胶回收
        4.2.9 回收DNA片段加“A”尾
        4.2.10 目的基因与T-Vector p MD19载体连接
        4.2.11 大肠杆菌转化
        4.2.12 重组质粒的提取
        4.2.13 转化结果及重组质粒的鉴定
        4.2.14 目的基因与过表达载体p CAMBIA1303连接转化
        4.2.15 转化结果鉴定
    4.3 结果与分析
        4.3.1 Gm MIPS1和Gm MIPS2基因的克隆
        4.3.2 重组质粒p MD19-Gm MIPS1和p MD19-Gm MIPS2的菌落PCR鉴定
        4.3.3 重组质粒p MD19-Gm MIPS1和p MD19-Gm MIPS2的双酶切鉴定
        4.3.4 过表达载体p CAMBIA1303的电泳检测
        4.3.5 重组质粒p CAMBIA1303-Gm MIPS1和p CAMBIA1303-Gm MIPS2的菌落PCR鉴定
        4.3.6 重组质粒p CAMBIA1303-Gm MIPS1和p CAMBIA1303-Gm MIPS2的双酶切鉴定
    4.4 本章小结
第五章 Gm MIPS1和Gm MIPS2蛋白的亚细胞定位
    5.1 材料
        5.1.1 植株材料
        5.1.2 菌种和载体
        5.1.3 供试载体和试剂
        5.1.4 培养基
        5.1.5 主要仪器
    5.2 方法
        5.2.1 试剂配制方法
        5.2.2 本生烟植株的培养
        5.2.3 农杆菌感受态细胞的制备
        5.2.4 瞬时表达载体转入农杆菌感受态细胞
        5.2.5 阳性克隆的筛选和鉴定
        5.2.6 Gm MIPS1和Gm MIPS2蛋白的亚细胞定位具体步骤
    5.3 结果与分析
    5.4 本章小结
第六章 结论与讨论
    6.1 结论
    6.2 讨论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表文章



本文编号：3863727