中蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交文库构建及与中蜂囊状幼虫病毒VP2互作宿主蛋白筛选

发布时间：2024-05-22 01:33

　　目的利用位点特异性重组技术(FullCoV技术)将中华蜜蜂幼虫膜蛋白cDNA连接到pPR3-N载体上,构建中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,利用该文库,筛选与中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood bee virus,CSBV)结构蛋白VP2相互作用的宿主蛋白,为进一步研究中蜂囊状幼虫病毒VP2功能奠定基础。方法提取2³日龄中蜂幼虫的总RNA,分离mRNA后,在反转录酶的作用下合成第一链的cDNA,并合成双链cDNA。在双链cDNA的5’端加上带有重组序列的接头后,通过FullCoV技术与载体pPR3-N进行连接,然后将连接产物电转化到感受态细胞(DH10B),构建中蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库,并对该文库插入片段大小和文库滴度进行检测。然后,将CSBV VP2基因分别克隆至pBT3STE和pBT3SUC载体,构建诱饵质粒pBT3STE-VP2和pBT3SUC-VP2,再将诱饵质粒pBT3STE-VP2和pBT3SUC-VP2分别转入酵母感受态细胞NMY32中,对其在酵母细胞中的表达功能及自激活能力进行检测。在此基础上,用25 mg的中蜂幼虫膜...

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【部分图文】：

图2-1中华蜜蜂幼虫的总RNAFig.2-1TotalRNAofChinesebeelarvae

图2-1中华蜜蜂幼虫的总RNAFig.2-1TotalRNAofChinesebeelarv离，经检测mRNA总量为5.6u

图2-2中华蜜蜂幼虫mRNA分离的结果

图2-2中华蜜蜂幼虫mRNA分离的结果2-2ChinesebeelarvalmRNAisolationr

图2-3电转化菌涂板后的生长情况

2.2.3文库滴度的计算取文库菌液10μL进行稀释100倍后，取10μL涂于固体培养基上，所构建的cDNA文库平板菌落统计结果共长了约300个克隆子，如图2-3所示。文库滴度为3×106cfu/mL。共计5mL的转化后原始菌液，则总库容量为：1.5×10....

图2-4中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库重组率及插入片段鉴定Fig.2-4RecombinationrateandinsertfragmentidentificationofmembraneproteinyeastcDNAlibraryof

图2-4中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库重组率及插入片段鉴ig.2-4RecombinationrateandinsertfragmentidentificationofmembraneproteinyeastApisceranacera....

本文编号：3980204