黑曲霉cbsA与cysA在抗氧化和菌植互作中的机制研究
发布时间：2023-02-08 19:52
黑曲霉(Aspergillus niger)是曲霉属真菌中的一个常见菌种,既是重要的工业发酵菌种,同时也是导致粮食和果蔬霉变的致病性真菌。真菌病原体侵染植物体时,植物宿主细胞会启动防御机制如活性氧自由基的爆发来限制病原菌的生长,同时病原菌会激活体内的抗氧化酶类和抗氧化物质,确保自身不会受到植物免疫应答带来的损伤,抗氧化酶和抗氧化物质在菌植互作中的机制研究一直是学者关注的课题。cbsA(An05g00160)和cysA(An12g09880)是黑曲霉中分别编码胱硫醚-β-合成酶和半胱氨酸合成酶的基因,它们与生物体内重要的抗氧化物质半胱氨酸、H2S的代谢密切相关,但在抗氧化及菌植互作中所起到的作用尚不清楚。本文以黑曲霉为实验材料,利用同源重组的技术原理,构建黑曲霉cbsA和cysA敲除载体,用PEG转化黑曲霉原生质体,通过基因组PCR和qRT-PCR的方法鉴定得到突变菌株ΔcbsA和ΔcysA。以突变菌株ΔcbsA和黑曲霉A.niger MA70.15(野生型)为材料开展以下工作。首先,在正常培养条件下,cbsA缺失不影响黑曲霉的生长而在GMM(缺乏氨基酸)培养基上生...
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
abstract
第一章 前言
1.1 黑曲霉概述
1.2 生物体内胱硫醚-β-合成酶概述
1.3 生物体内半胱氨酸合成酶概述
1.4 半胱氨酸和H2S的生理功能概述
1.4.1 半胱氨酸的生理功能
1.4.2 H2S的生理功能
1.5 课题研究的目的、意义及内容
1.5.1 课题研究的目的和意义
1.5.2 课题研究的主要内容
第二章 黑曲霉cbsA与cysA缺失载体的构建和突变菌株的筛选
2.1 实验材料、试剂及仪器
2.1.1 实验材料
2.1.2 主要试剂
2.1.3 溶液的配制
2.1.4 培养基配制
2.1.5 主要设备
2.2 实验方法
2.2.1 构建黑曲霉基因cbsA和cysA缺失载体
2.2.2 黑曲霉原生质体制备及聚乙二醇转化
2.2.3 黑曲霉突变菌种的筛选及鉴定
2.3 结果与分析
2.3.1 cbsA和cysA上下游片段AB、CD的克隆、纯化及连接
2.3.2 pC3质粒的双酶切及cbsA和cysA的 PCR鉴定
2.3.3 黑曲霉cbsA和cysA缺失体的基因组PCR鉴定
2.3.4 黑曲霉cbsA和cysA缺失体的qPCR鉴定
第三章 黑曲霉cbsA的功能研究
3.1 实验材料、试剂及仪器
3.1.1 实验材料
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器设备
3.2 实验方法
3.2.1 胱硫醚-β-合成酶的生物信息学分析
3.2.2 黑曲霉突变体ΔcbsA生长状况的观察
3.2.3 GMM培养基中黑曲霉的生长状况
3.2.4 黑曲霉体内Cys、GSH、H2S含量的检测
3.2.5 黑曲霉菌丝体在不同非生物胁迫下的生长情况
3.2.6 黑曲霉菌体孢子萌发情况的观察
3.2.7 黑曲霉突变体ΔcbsA对采后果实侵染能力的检测
3.2.8 黑曲霉侵染后梨中ROS和MDA含量的检测
3.3 结果与分析
3.3.1 黑曲霉cbsA的生物信息学分析
3.3.2 cbsA基因的缺失对黑曲霉生长的影响
3.3.3 氨基酸缺乏培养基对野生型菌株和ΔcbsA突变体生长的影响
3.3.4 cbsA基因缺失对黑曲霉半胱氨酸,谷胱甘肽和硫化氢含量的影响
3.3.5 不同非生物胁迫对野生型菌株和ΔcbsA突变体生长的影响
3.3.6 镉胁迫下对野生型菌株和ΔcbsA突变体生长的影响
3.3.7 黑曲霉对中国白梨的侵染能力分析
3.3.8 黑曲霉侵染梨果实后ROS代谢的变化
3.4 讨论与小结
第四章 黑曲霉cbsA原核表达载体的构建与酶学性质研究
4.1 实验材料、试剂及仪器
4.1.1 菌体、载体及植株
4.1.2 培养基的配制
4.1.3 试剂和仪器
4.2 实验方法
4.2.1 引物设计
4.2.2 黑曲霉和番茄RNA的提取及反转录
4.2.3 目的基因cbsA,CS和CSX1 的克隆及线性载体的构建
4.2.4 重组载体的构建、转化与鉴定
4.2.5 重组质粒的双酶切鉴定及测序鉴定
4.2.6 重组质粒的二次转化(DE3)
4.2.7 cbsA,CS和CSX1 的诱导表达及酶活测定
4.3 结果与讨论
4.3.1 cbsA,CS和CSX1的克隆及线性化载体的制备
4.3.2 cbsA,CS和CSX1 大肠杆菌菌落鉴定和质粒的双酶切鉴定
4.3.3 cbsA,CS和CSX1 的测序鉴定
4.3.4 cbsA,CS和CSX1 大肠杆菌的菌落鉴定
4.3.5 大肠杆菌中重组基因的诱导表达
4.3.6 蛋白cbsA,CS和CSX1 酶活的检测
第五章 黑曲霉cysA基因功能研究
5.1 实验材料、试剂及仪器
5.1.1 实验材料
5.1.2 主要试剂
5.1.3 主要设备
5.2 实验方法
5.2.1 半胱氨酸合成酶的生物信息学分析
5.2.2 不同非生物胁迫条件下黑曲霉菌株的生长分析
5.2.3 cysA基因的缺失对黑曲霉半胱氨酸合成酶活性及半胱氨酸含量的影响
5.2.6 黑曲霉菌体内多种编码半胱氨酸合成酶基因的表达水平分析
5.3 结果与讨论
5.3.1 真菌中半胱氨酸合成酶基因的生物信息学分析
5.3.2 cysA基因缺失对黑曲霉生长的影响
5.3.3 氨基酸缺乏培养基对野生型菌株和ΔcysA突变体生长的影响
5.3.4 不同非生物胁迫对黑曲霉MA70.15(WT)和ΔcysA突变体生长的影响
5.3.5 黑曲霉MA70.15(WT)和ΔcysA突变体对果实的侵染能力
5.3.6 cysA基因缺失对黑曲霉半胱氨酸合酶活性和半胱氨酸含量的影响..
5.3.7 cysA基因缺失对黑曲霉中编码半胱氨酸合酶的其他基因表达的影响
5.4 讨论与小结
参考文献
附录
蛋白电泳相关溶液配制
黑曲霉ΔcysA和WT在不同浓度的非生物胁迫的生长
攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况
1)参加的学术交流与科研项目
1)发表的学术论文
本文编号：3738275
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
abstract
第一章 前言
1.1 黑曲霉概述
1.2 生物体内胱硫醚-β-合成酶概述
1.3 生物体内半胱氨酸合成酶概述
1.4 半胱氨酸和H2S的生理功能概述
1.4.1 半胱氨酸的生理功能
1.4.2 H2S的生理功能
1.5 课题研究的目的、意义及内容
1.5.1 课题研究的目的和意义
1.5.2 课题研究的主要内容
第二章 黑曲霉cbsA与cysA缺失载体的构建和突变菌株的筛选
2.1 实验材料、试剂及仪器
2.1.1 实验材料
2.1.2 主要试剂
2.1.3 溶液的配制
2.1.4 培养基配制
2.1.5 主要设备
2.2 实验方法
2.2.1 构建黑曲霉基因cbsA和cysA缺失载体
2.2.2 黑曲霉原生质体制备及聚乙二醇转化
2.2.3 黑曲霉突变菌种的筛选及鉴定
2.3 结果与分析
2.3.1 cbsA和cysA上下游片段AB、CD的克隆、纯化及连接
2.3.2 pC3质粒的双酶切及cbsA和cysA的 PCR鉴定
2.3.3 黑曲霉cbsA和cysA缺失体的基因组PCR鉴定
2.3.4 黑曲霉cbsA和cysA缺失体的qPCR鉴定
第三章 黑曲霉cbsA的功能研究
3.1 实验材料、试剂及仪器
3.1.1 实验材料
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器设备
3.2 实验方法
3.2.1 胱硫醚-β-合成酶的生物信息学分析
3.2.2 黑曲霉突变体ΔcbsA生长状况的观察
3.2.3 GMM培养基中黑曲霉的生长状况
3.2.4 黑曲霉体内Cys、GSH、H2S含量的检测
3.2.5 黑曲霉菌丝体在不同非生物胁迫下的生长情况
3.2.6 黑曲霉菌体孢子萌发情况的观察
3.2.7 黑曲霉突变体ΔcbsA对采后果实侵染能力的检测
3.2.8 黑曲霉侵染后梨中ROS和MDA含量的检测
3.3 结果与分析
3.3.1 黑曲霉cbsA的生物信息学分析
3.3.2 cbsA基因的缺失对黑曲霉生长的影响
3.3.3 氨基酸缺乏培养基对野生型菌株和ΔcbsA突变体生长的影响
3.3.4 cbsA基因缺失对黑曲霉半胱氨酸,谷胱甘肽和硫化氢含量的影响
3.3.5 不同非生物胁迫对野生型菌株和ΔcbsA突变体生长的影响
3.3.6 镉胁迫下对野生型菌株和ΔcbsA突变体生长的影响
3.3.7 黑曲霉对中国白梨的侵染能力分析
3.3.8 黑曲霉侵染梨果实后ROS代谢的变化
3.4 讨论与小结
第四章 黑曲霉cbsA原核表达载体的构建与酶学性质研究
4.1 实验材料、试剂及仪器
4.1.1 菌体、载体及植株
4.1.2 培养基的配制
4.1.3 试剂和仪器
4.2 实验方法
4.2.1 引物设计
4.2.2 黑曲霉和番茄RNA的提取及反转录
4.2.3 目的基因cbsA,CS和CSX1 的克隆及线性载体的构建
4.2.4 重组载体的构建、转化与鉴定
4.2.5 重组质粒的双酶切鉴定及测序鉴定
4.2.6 重组质粒的二次转化(DE3)
4.2.7 cbsA,CS和CSX1 的诱导表达及酶活测定
4.3 结果与讨论
4.3.1 cbsA,CS和CSX1的克隆及线性化载体的制备
4.3.2 cbsA,CS和CSX1 大肠杆菌菌落鉴定和质粒的双酶切鉴定
4.3.3 cbsA,CS和CSX1 的测序鉴定
4.3.4 cbsA,CS和CSX1 大肠杆菌的菌落鉴定
4.3.5 大肠杆菌中重组基因的诱导表达
4.3.6 蛋白cbsA,CS和CSX1 酶活的检测
第五章 黑曲霉cysA基因功能研究
5.1 实验材料、试剂及仪器
5.1.1 实验材料
5.1.2 主要试剂
5.1.3 主要设备
5.2 实验方法
5.2.1 半胱氨酸合成酶的生物信息学分析
5.2.2 不同非生物胁迫条件下黑曲霉菌株的生长分析
5.2.3 cysA基因的缺失对黑曲霉半胱氨酸合成酶活性及半胱氨酸含量的影响
5.2.6 黑曲霉菌体内多种编码半胱氨酸合成酶基因的表达水平分析
5.3 结果与讨论
5.3.1 真菌中半胱氨酸合成酶基因的生物信息学分析
5.3.2 cysA基因缺失对黑曲霉生长的影响
5.3.3 氨基酸缺乏培养基对野生型菌株和ΔcysA突变体生长的影响
5.3.4 不同非生物胁迫对黑曲霉MA70.15(WT)和ΔcysA突变体生长的影响
5.3.5 黑曲霉MA70.15(WT)和ΔcysA突变体对果实的侵染能力
5.3.6 cysA基因缺失对黑曲霉半胱氨酸合酶活性和半胱氨酸含量的影响..
5.3.7 cysA基因缺失对黑曲霉中编码半胱氨酸合酶的其他基因表达的影响
5.4 讨论与小结
参考文献
附录
蛋白电泳相关溶液配制
黑曲霉ΔcysA和WT在不同浓度的非生物胁迫的生长
攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况
1)参加的学术交流与科研项目
1)发表的学术论文
本文编号：3738275
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