日本海马白斑状皮肤溃烂病病原学及组织病理学研究

发布时间：2020-04-14 22:29

【摘要】：日本海马（Hippocampus japonicus）在试验室养殖过程得了溃疡症，其主要症状表现为皮肤溃烂、肝脏糜烂、肠道发白或透明等，不及时隔离治疗会导致全部死亡。本研究的目的是分离和鉴定日本海马溃疡症的病原。从患有溃疡症的濒死日本海马的皮肤溃烂部位、肝脏等分离病原菌；通过形态特征、生理生化特征及16S rDNA基因系统发育分析对病原菌进行分类鉴定；通过药敏试验来确定该病原菌对抗生素的敏感性；通过人工感染试验来确定该菌对日本海马的致病性；从病变日本海马分离得到两株优势菌分别为HM16和HC2；综合菌株HM16和HC2的形态、生理生化特征及16S rDNA系统发育分析等方面的试验结果，分别确定HM16为弧菌属(Vibrio sp.)细菌和HC2为假单胞杆菌属（Pseudomonas sp.）细菌。人工感染试验证实HM16和HC2均为日本海马的病原菌，HM16和HC2对日本海马的半数致死剂量（LD50）分别为7.9×102cfu/g（鱼）和1.6×103cfu/ind（鱼）。HM16对头孢他啶、菌必治、链霉素、氯霉素和红霉素等表现出强敏感性；HC2对氨苄青霉素、羧苄青霉素、氧哌嗪青霉素、复达欣、菌必治、新霉素和氧氟沙星等表现出强敏感性。从健康日本海马（H. japonicus）肠道内分离获得对其肠炎病病原菌HC2具有显著拮抗作用的菌株，优化其产生抑菌活性物质的发酵条件，为海马生物防治奠定基础。采用点种法并以日本海马肠炎病病原菌HC2为指示菌，对从健康日本海马肠道内分离的56株细菌进行体外拮抗试验。根据菌株的形态特征、生理生化特征和16S rDNA系统发育树分析对其进行鉴定。通过最优培养基成分的选择、培养基组分的正交试验优化和单因素试验来确定优化发酵条件。从日本海马肠道内筛选出一株拮抗菌，编号为HS17。综合该菌的形态、生理生化以及16S rDNA系统发育树分析等方面的试验结果，确定菌株HS17属于芽孢杆菌属(Bacilus sp.)。该菌生长的最佳碳源、氮源和磷酸盐分别为蛋白胨、麦芽糖和KH2PO4；其最佳发酵配方和发酵条件为蛋白胨(20.0g/L)、麦芽糖(10.0g/L)、KH2PO4(1.5g/L)、NaCl(10.0g/L)和MgSO4·7H2O(0.2g/L)，初始pH为7.0，接种量为3%，装瓶量为30mL/100mL，转速为180r/min，培养时间为48h。通过发酵条件优化后菌株HS17对病原菌HC2的抑制效果更加明显。组织病理学研究表明：病变日本海马的表皮完全脱落，结缔组织结构严重变形，并产生大量酸性物质；尾部溃烂部位，软骨严重损伤，肌肉浓缩，细胞核出现凝聚，且产生大量酸性物质；皮肤的色素层脱落，且分散在真皮层的黄色色素细胞和红色色素细胞消失；肝脏内血管破裂，出现红细胞浸润现象，并出现大量空泡，肝细胞之间出现断裂，肝细胞破坏，细胞核游离，且肝细胞产生大量酸性物质。
【图文】：

菌株,特征鉴定,试剂条,弧菌属

图 2-1 菌株 HM16 的电镜照片Figure 2-1 The electron micrograph of strain HM166 的生长温度范围为 10℃～45℃，最适生长温度为 25℃NaCl）范围为 0.5%～11%，最佳绝对盐度（NaCl）为 1 5～10，最适 pH 为 6～8。特征鉴定结果6 在麦康凯培养基上可以生长，在绵羊血平板上呈 β 型脂酶（Tween80）、卵磷脂酶试验结果均为阳性；酪蛋白基红、VP 试验结果均为阴性（表 2-1）。依据 API 20E表比对结果可知，菌株 HM16 属于弧菌属（Vibrio sp.），E 试剂条鉴定结果见表 2-1。

系统发育树,基因序列,日本海马,菌株

图 2-2 16S rDNA 基因序列的 NJ 法构建菌株 HM16 的系统发育树Figure2-2 Phylogenetic tree of strain HM16 based on 16S rDNA gene sequences. The numbers athe nodes indicate the bootstrap values based on neighbor-joining analyses of 1000 sample datesets. Bar, 0.002 substitutions per nucleotide position. The numbers in parentheses are accessionnumber of sequences.2.2.7 人工感染试验结果腹腔注射感染后，日本海马的发病症状与自然发病症状较为相似。当菌株HM16 浓度≥5.3×108cfu/mL 时，日本海马在第 1 天就开始死亡，死亡症状为颈部和躯干部体表发白并开始溃烂，肝脏糜烂等，3d 内死亡率为 100%；当菌注射浓度≥5.3×106cfu/mL 时，日本海马在第 4d 出现死亡，，详情见表 2-3。从感染死亡的日本海马的溃烂的躯干部皮肤和肝脏等，再次分离、纯化优势菌，经生理生化和 16rDNA 鉴定，确定就是菌株 HM16。按照 Probit 法计算出菌株 HM16 对日本海马半数致死量（LD50）为 7.9×102cfu/g（鱼）（9.9×102cfu/ind）。
【学位授予单位】：鲁东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S947.9

【参考文献】