大鲵Ⅰ型干扰素基因的克
发布时间：2023-04-29 19:14
中国大鲵(Andrias davidianus)是我国珍稀的名贵特产,也是目前世界上个体最大的两栖类动物。由于大鲵属于野生动物从水生向陆生过渡的物种,因此在研究物种起源、进化、生物多样性、基因变异等方面具有重要的科学意义。不仅如此,大鲵还具有丰富的营养价值和药用价值。近年来,随着我国大鲵养殖规模的不断扩大,大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus)所引起的病毒性疾病给大鲵的养殖业造成了重大经济损失。因而开展大鲵抗病毒防御机制的研究对其病毒性疾病的防控具有重要意义。干扰素(Interferon,IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和调节免疫功能的细胞因子。目前除模式生物非洲爪蟾外,其他两栖类动物的Ⅰ型干扰素基因的抗病毒功能鲜有研究。本文克隆与分析了大鲵Ⅰ型干扰素c DNA全长及基因组结构,在细胞水平上验证其抗病毒功能,旨在为研究大鲵免疫防御系统与抗病毒感染机制奠定基础。主要结果如下:1.以中国大鲵肾脏组织总RNA为模板,利用RACE PCR技术克隆得到大鲵Ⅰ型干扰素(gs IFN)c DNA全长,其全长1113 bp,编码186个氨基酸。氨基酸...
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表（按字母顺序排列）
第一章 文献综述
1 Ⅰ型干扰素研究进展
1.1 Ⅰ型干扰素的分子结构
1.2 Ⅰ型干扰素的分泌
1.3 Ⅰ型干扰素的受体和信号通路
1.3.1 Ⅰ型干扰素受体
1.3.2 Ⅰ型干扰素信号通路
1.4 Ⅰ型干扰素生物学活性
1.4.1 抗病毒作用
1.4.2 免疫调节功能
1.4.3 抑制细胞增殖与抗肿瘤活性
1.4.4 诱导细胞凋亡
1.4.5 Ⅰ型干扰素的应用
2 中国大鲵虹彩病毒研究进展
2.1 大鲵虹彩病毒的发现
2.2 大鲵虹彩病毒病的流行特征与临床症状
2.3 大鲵虹彩病毒理化特性与生物学特性
2.4 大鲵虹彩病毒检测方法
2.4.1 细胞培养技术
2.4.2 分子生物学检测
2.4.3 电镜观察
2.4.4 免疫学检测
2.5 大鲵虹彩病毒病的防控
3 两栖类动物抗病毒免疫的研究
3.1 两栖动物免疫系统
3.1.1 非特异性免疫系统
3.1.2 特异性免疫系统
3.2 非洲爪蟾对病毒的免疫应答
3.3 蝾螈对病毒的免疫应答
3.4 虹彩病毒的免疫逃逸策略
4 研究目的与意义
第二章 大鲵Ⅰ型干扰素基因的克隆与生物信息学分析
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物和菌种
1.1.2 实验试剂和耗材
1.1.3 实验仪器和设备
1.2 实验方法
1.2.1 大鲵组织样品总RNA和总DNA的提取
1.2.1.1 大鲵肾脏组织总RNA的提取
1.2.1.2 大鲵肝脏组织总DNA的提取
1.2.2 5’-RACE和 3’-RACE末端c DNA合成
1.2.3 RACE法扩增大鲵TypeⅠIFN基因c DNA全长
1.2.4 染色体步移技术扩增大鲵TypeⅠIFN基因全长
1.2.5 生物信息学分析
2 实验结果
2.1 大鲵TypeⅠIFN (gs IFN) 的核苷酸序列和氨基酸序列分析
2.2 gs IFN基因结构分析
2.3 gs IFN氨基酸多重序列比对分析
2.4 gs IFN氨基酸进化树分析
3 讨论
第三章 大鲵Ⅰ型干扰素的组织表达分布与诱导表达
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 细胞和病毒
1.1.3 实验试剂和耗材
1.1.4 实验仪器和设备
1.2 实验方法
1.2.1 大鲵虹彩病毒GSIV的培养与滴度测定
1.2.2 各组织RNA的提取和c DNA合成
1.2.3 gs IFN荧光定量引物的设计和合成
1.2.4 荧光定量PCR检测gs IFN在各组织中的分布
1.2.5 大鲵外周血白细胞 (peribheral blood leucocytes, PBLs) 的分离
1.2.6 Poly I:C和大鲵虹彩病毒 (GSIV) 体外诱导PBLs中gs IFN的表达
1.2.7 数据分析
2 实验结果
2.1 gs IFN荧光定量引物筛选
2.2 荧光定量检测gs IFN在大鲵各组织表达分布
2.3 荧光定量检测poly I:C诱导大鲵PBLs中gs IFN表达
2.4 荧光定量检测GSIV诱导大鲵PBLs中gs IFN表达
3 讨论
第四章 大鲵Ⅰ型干扰素真核表达载体的构建及功能研究
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞和病毒
1.1.2 实验试剂和耗材
1.1.3 实验仪器和设备
1.2 实验方法
1.2.1 引物的设计和合成
1.2.2 真核表达质粒p EGFP-N1-IFN的构建
1.2.2.1 gs IFN ORF片段扩增
1.2.2.2 p MD19-T-IFN和真核表达质粒p EGFP-N1双酶切与链接
1.2.2.3 转染用真核表达质粒的制备
1.2.3 真核表达质粒p EGFP-N1-IFN转染GS-M细胞与细胞筛选
1.2.3.1 GS-M细胞转染
1.2.3.2 GS-M转染阳性克隆筛选
1.2.4 GS-M中过表达gs IFN后抗病毒功能研究
1.2.4.1 荧光定量检测GSIV感染过表达细胞后相关基因的表达
1.2.4.2 间接荧光免疫检测GSIV感染过表达细胞MCP蛋白的表达
1.2.5 数据分析
2 实验结果
2.1 p EGFP-N1-IFN表达质粒的构建
2.1.1 gs IFN基因ORF的扩增
2.1.2 阳性克隆的筛选与酶切鉴定
2.1.3 重组质粒p EGFP-N1-IFN转染GS-M细胞
2.2 过表达细胞感染GSIV后Mx基因的表达
2.3 gs IFN过表达细胞感染GSIV细胞形态观察
2.4 gs IFN抑制GSIV病毒在GS-M细胞中增殖
2.4.1 荧光定量检测病毒MCP和IE-ICP46基因表达
2.4.2 GSIV病毒滴度的测定
2.4.3 间接荧光免疫检测MCP蛋白的表达
3 讨论
总结
参考文献
附录
致谢
本文编号：3805580
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表（按字母顺序排列）
第一章 文献综述
1 Ⅰ型干扰素研究进展
1.1 Ⅰ型干扰素的分子结构
1.2 Ⅰ型干扰素的分泌
1.3 Ⅰ型干扰素的受体和信号通路
1.3.1 Ⅰ型干扰素受体
1.3.2 Ⅰ型干扰素信号通路
1.4 Ⅰ型干扰素生物学活性
1.4.1 抗病毒作用
1.4.2 免疫调节功能
1.4.3 抑制细胞增殖与抗肿瘤活性
1.4.4 诱导细胞凋亡
1.4.5 Ⅰ型干扰素的应用
2 中国大鲵虹彩病毒研究进展
2.1 大鲵虹彩病毒的发现
2.2 大鲵虹彩病毒病的流行特征与临床症状
2.3 大鲵虹彩病毒理化特性与生物学特性
2.4 大鲵虹彩病毒检测方法
2.4.1 细胞培养技术
2.4.2 分子生物学检测
2.4.3 电镜观察
2.4.4 免疫学检测
2.5 大鲵虹彩病毒病的防控
3 两栖类动物抗病毒免疫的研究
3.1 两栖动物免疫系统
3.1.1 非特异性免疫系统
3.1.2 特异性免疫系统
3.2 非洲爪蟾对病毒的免疫应答
3.3 蝾螈对病毒的免疫应答
3.4 虹彩病毒的免疫逃逸策略
4 研究目的与意义
第二章 大鲵Ⅰ型干扰素基因的克隆与生物信息学分析
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物和菌种
1.1.2 实验试剂和耗材
1.1.3 实验仪器和设备
1.2 实验方法
1.2.1 大鲵组织样品总RNA和总DNA的提取
1.2.1.1 大鲵肾脏组织总RNA的提取
1.2.1.2 大鲵肝脏组织总DNA的提取
1.2.2 5’-RACE和 3’-RACE末端c DNA合成
1.2.3 RACE法扩增大鲵TypeⅠIFN基因c DNA全长
1.2.4 染色体步移技术扩增大鲵TypeⅠIFN基因全长
1.2.5 生物信息学分析
2 实验结果
2.1 大鲵TypeⅠIFN (gs IFN) 的核苷酸序列和氨基酸序列分析
2.2 gs IFN基因结构分析
2.3 gs IFN氨基酸多重序列比对分析
2.4 gs IFN氨基酸进化树分析
3 讨论
第三章 大鲵Ⅰ型干扰素的组织表达分布与诱导表达
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 细胞和病毒
1.1.3 实验试剂和耗材
1.1.4 实验仪器和设备
1.2 实验方法
1.2.1 大鲵虹彩病毒GSIV的培养与滴度测定
1.2.2 各组织RNA的提取和c DNA合成
1.2.3 gs IFN荧光定量引物的设计和合成
1.2.4 荧光定量PCR检测gs IFN在各组织中的分布
1.2.5 大鲵外周血白细胞 (peribheral blood leucocytes, PBLs) 的分离
1.2.6 Poly I:C和大鲵虹彩病毒 (GSIV) 体外诱导PBLs中gs IFN的表达
1.2.7 数据分析
2 实验结果
2.1 gs IFN荧光定量引物筛选
2.2 荧光定量检测gs IFN在大鲵各组织表达分布
2.3 荧光定量检测poly I:C诱导大鲵PBLs中gs IFN表达
2.4 荧光定量检测GSIV诱导大鲵PBLs中gs IFN表达
3 讨论
第四章 大鲵Ⅰ型干扰素真核表达载体的构建及功能研究
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞和病毒
1.1.2 实验试剂和耗材
1.1.3 实验仪器和设备
1.2 实验方法
1.2.1 引物的设计和合成
1.2.2 真核表达质粒p EGFP-N1-IFN的构建
1.2.2.1 gs IFN ORF片段扩增
1.2.2.2 p MD19-T-IFN和真核表达质粒p EGFP-N1双酶切与链接
1.2.2.3 转染用真核表达质粒的制备
1.2.3 真核表达质粒p EGFP-N1-IFN转染GS-M细胞与细胞筛选
1.2.3.1 GS-M细胞转染
1.2.3.2 GS-M转染阳性克隆筛选
1.2.4 GS-M中过表达gs IFN后抗病毒功能研究
1.2.4.1 荧光定量检测GSIV感染过表达细胞后相关基因的表达
1.2.4.2 间接荧光免疫检测GSIV感染过表达细胞MCP蛋白的表达
1.2.5 数据分析
2 实验结果
2.1 p EGFP-N1-IFN表达质粒的构建
2.1.1 gs IFN基因ORF的扩增
2.1.2 阳性克隆的筛选与酶切鉴定
2.1.3 重组质粒p EGFP-N1-IFN转染GS-M细胞
2.2 过表达细胞感染GSIV后Mx基因的表达
2.3 gs IFN过表达细胞感染GSIV细胞形态观察
2.4 gs IFN抑制GSIV病毒在GS-M细胞中增殖
2.4.1 荧光定量检测病毒MCP和IE-ICP46基因表达
2.4.2 GSIV病毒滴度的测定
2.4.3 间接荧光免疫检测MCP蛋白的表达
3 讨论
总结
参考文献
附录
致谢
本文编号：3805580
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/3805580.html
