麦芽糖基结合位点2区域对环糊精葡萄糖基转移酶产物抑制的影响研究

发布时间：2020-05-29 21:49

【摘要】：环糊精具有包合许多疏水性化合物而改善它们使用性能的作用,在各个领域具有广泛应用。工业上,环糊精的制备一般通过环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)作用于淀粉制备而成,但随着产物的积累,会出现明显的产物抑制现象,是造成环糊精产量较低的一个重要因素,因此,如何降低环糊精生产过程中的产物抑制成为一个亟待解决的问题。本研究选取2种具有不同产物抑制类型的CGT酶(α-CGT酶来源于Paenibacillus macerans JFB05-01,β-CGT酶来源于Bacillus circulans STB01)为研究对象,通过生物信息学手段从酶一级结构入手,深入分析酶结构与产物抑制的关系。然后,通过单突变、双突变及片段替换对麦芽糖基结合位点2(MBS2)区域进行分子改造,以研究MBS2区域对CGT酶产物抑制的影响,并对相关机理进行了分析,同时期望得到产物抑制降低、具有工业应用价值的理想突变体。主要研究结果如下:(1)对CGT酶进行生物信息学分析,从一级结构入手,深入分析造成CGT酶产物抑制的原因,明确与CGT酶产物抑制相关的区域及氨基酸残基。根据α-CGT酶和β-CGT酶的产物抑制差异以及MBS2区域的特殊性,选定MBS2区域为研究目标,并选取该区域的600位点和603位点及整体进行结构分析,为后续突变体的构建提供指导。(2)选取MBS2区域的600位点,分别设计了4个α-CGT酶单突变体(Y600L、Y600E、Y600I和Y600R)和4个β-CGT酶单突变体(L600Y、L600E、L600I和L600R)进行比较研究。结果发现,α-CGT酶600位点突变既不改变α-CGT酶的产物抑制类型,仍为竞争性抑制,也不改变其产物抑制强弱;而β-CGT酶600位点突变体的产物抑制类型虽未发生改变,仍为线性混合型抑制,但其产物抑制强弱受到明显影响。可以推断,环糊精对α-CGT酶产生的竞争性抑制与其非活性区域MBS2的600位点没有相关性,而环糊精对β-CGT酶产生的线性混合型抑制尤其是非竞争性抑制与600位点有一定的关联性。机理分析显示,β-CGT酶600位点突变后,600位点处的氨基酸与环糊精之间的疏水相互作用减弱,进而导致产物抑制的降低。(3)选取MBS2区域的603位点,分别设计了6个α-CGT酶单突变体(N603E、N603D、N603K、N603H、N603R和N603I)和6个β-CGT酶单突变体(N603E、N603D、N603K、N603H、N603R和N603I)进行比较研究。结果发现,603位点单突变对α-CGT酶和β-CGT酶的影响同600位点类似,但其中,2种酶的N603E和N603D竞争性抑制均发生明显变化。可以推断,MBS2区域的603位点也与β-CGT酶的非竞争性抑制密切相关,而2种酶N603E和N603D的竞争性抑制强度变化可能与另一个竞争区域(MBS1)有关。机理分析显示,野生型β-CGT酶603位点处的Asn通过水介导的氢键与环糊精相结合,当突变成带负电荷的Glu、Asp或者疏水性的Ile时,氢键被破坏,产物抑制降低,而突变成Lys、His和Arg后,侧链氨基的存在仍导致氢键的存在,甚至更强,产物抑制更严重。(4)在前面基础上,对β-CGT酶设计了2个双突变体(N603D/L600R和N603D/L600E)和片段替换突变体(MBS2-Bc DF9R)进行进一步研究。结果发现,N603D/L600R和N603D/L600E以及MBS2-Bc DF9R均具有更好的产物抑制降低效果。当以5%麦芽糊精(DE=4)为底物进行环糊精生产时,在相同酶蛋白添加量下,双突变体N603D/L600R和N603D/L600E的主产物β-环糊精比野生型分别高出43.7%和27.9%,具有潜在的工业应用价值。
【图文】：

示意图,晶体结构,淀粉糊精,糊精

图 1-2 CGT 酶的晶体结构Fig. 1-2 Crystal structure of CGTase利用水解、歧化、环化和偶合功能催化淀粉糊精类[25,26]，反应示意图如图 1-3 所示。其于淀粉或相关基质生成环糊精，，是环糊精工

示意图,酶催化反应,示意图,环状构造

2图 1-3 CGT 酶催化反应示意图[27]葡萄糖残基，灰色小球代表还原性末端的葡应；(B) 歧化反应；(C) 环化反应；(D) 偶. 1-3 Schematic of CGTase-catalyzed reactionst glucose resides and gray balls represent reduc Disproportion reaction; (C) Cyclization reactio化机理见图 1-4，其发生在同一分子上物结合，在氨基酸 Asp229 和 Glu257 作一端靠近，形成环状构造；最后，OH
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.2

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