基于核酸适配体可视化检测水产品中孔雀石绿

发布时间：2020-09-03 09:22

　　孔雀石绿(MG)因具有较强的杀虫、抗菌和防止感染等效果,被非法用于水产养殖中,但由于MG进入人体后具有致畸、致癌和致突变等危害。因此,开展快速、准确的MG残留检测方法十分重要。本文基于核酸适配体的特异识别能力,建立了MG的可视化检测方法,并成功地应用于鱼肉和养殖水样中MG的快速检测。论文主要内容如下:第一部分,基于纳米金(AuNPs)和RNA适配体可视化检测MG。利用盐(NaCl)导致AuNPs团聚,溶液颜色由红色变成蓝色,而MG-RNA适配体可通过静电吸附保护AuNPs,使其在盐溶液中不发生聚集而呈红色。但当体系中有MG存在时,RNA适配体从AuNPs表面脱离并与MG特异性结合,使游离的AuNPs遇盐而发生聚集呈蓝色。随着MG浓度的增大,溶液于520 nm处的吸光度值逐渐降低,而690 nm处的吸光度值逐渐升高,即溶液颜色由红色逐渐变为蓝色。因此,可通过肉眼观察溶液颜色变化或通过吸光度值来确定MG含量,整个检测过程不超过1小时。当NaCl浓度为0.2 mol L~(-1)、RNA浓度为10μmol L~(-1)及AuNPs的浓度为7 nmol L~(-1)时,MG的检测线性范围为0.6~12.5μmol L~(-1)(线性方程为Δ(A_(690)/A_(520))=0.06C-0.01,R~2为0.993),检出限0.04μmol L~(-1)(3α/κ,n=9)。将此方法应用于养殖水样中MG的检测,加标回收率为92%~108%,说明方法对MG残留的检测具有巨大潜力。第二部分,基于DNA适配体抑制Fe_3O_4NPs模拟酶催化活性的MG可视化检测方法。Fe_3O_4纳米粒子(Fe_3O_4NPs)具有很强的催化活性,能够催化H_2O_2氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB),使溶液由无色变为蓝色。然而,Fe_3O_4NPs的催化活性可被MG-DNA适配体抑制,使溶液蓝色变浅。当MG存在时,DNA适配体与MG特异性结合,此时Fe_3O_4NPs的催化活性恢复。因此,根据溶液颜色的变化或650 nm处吸光度值的变化即可确定MG的含量。基于该可视化检测法,MG的检测范围为0.1~1μmol L~(-1),检出限为9.5 nmol L~(-1)(3σ/k,n=9)。将此方法用于养殖水及鱼肉中MG的检测,加标回收率为80%~120%,RSD小于6.4%。方法快速、灵敏、特异性强。第三部分,基于CTAB抑制AuNPs过氧化物模拟酶活性的MG可视化检测方法。AuNPs具有较强的过氧化物酶活性,可催化TMB与H_2O_2的氧化反应,使溶液颜色变蓝。但是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)可导致AuNPs聚集而抑制其催化活性。当加入MG-RNA适配体后,带负电荷的RNA适配体可与CTAB阳离子结合,使AuNPs催化活性恢复。然而,当检测体系存在MG时,MG与RNA适配体特异性结合,释放的CTAB可导致AuNPs团聚使溶液颜色变浅。因此,通过溶液颜色的变化或650 nm处吸光度值的变化,可确定浓度范围为0.01~2μmol L~(-1)的MG含量,检出限为1.8 nmol L~(-1)。将此方法用于养殖水样中MG的检测,加标回收率为80~120%,与HPLC及ELISA的检测结果一致,说明方法适应性强。
【学位单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS254.7
【部分图文】：

原理图,筛选技术,原理图,适配体

图 1-1 SELEX 筛选技术原理图[24]Fig. 1-1. General scheme of the SELEX procedure[24]酸适配体在小分子快速检测中的应用来，食品质量安全问题日益凸显，危害食品质量安全的小分子有害物质配体是一种单链寡核苷酸结合分子，这些功能性 DNA 或 RNA 结构可和力和特异性的靶点，因此，基于核酸适配体的检测法常被用于小分见的基于核酸适配体快速检测食品中小分子的方法有以下几种：）比色/荧光法核酸适配体快速检测小分子的比色和荧光法常用到纳米金（AuNPs）单、稳定性强、具有独特的光电性质，以及可以通过改变大小形状和性质等特点，被广泛应用于构建生物、化学传感领域中[34, 35]。定条件下，AuNPs 会发生聚集诱导粒子间表面等离子体偶联，肉眼可[36][

碱基序列,适配体,碱基,红色

以实现对 ATP 的简单、快速检测，检出限链反应和 AuNPs 可视化检测甲基化 DNA 的变化，可检测到 0.01 fmol L-1的甲基化 DN分子识别中起到关键作用，基于核酸适配体[75-77]由 38 个碱基组成，如图 2-1 所示，其结构，以及由 10 个碱基和 6 个碱基组成的ACUGGCGAGAGCCAGGUAACGAAUGGA 适配体可以剪裁成 27 个碱基序列，与 3 研究使用 27 个碱基序列的 MG-RAGGUAACGAAUGGA-3’。和 RNA 适配体建立了可视化检测 MG 的方受盐诱导的聚集作用，使 AuNPs 呈分散状 MG 特异结合，导致 AuNPs 失去保护而聚可见光度法可检测出溶液在 520 nm 和 690度高、选择性强，可用于水产养殖水样中微

原理图,适配体,无标记,可视化

学位论文基于核酸适配体可视化检测水产品中孔雀石绿12图2-2 基于核酸适配体和无标记AuNPs可视化检测MG的原理图Fig. 2-2. Schematic illustration of the colorimetric assay for MG based on the specific aptamer andunmodified AuNPs图 2-2 为基于 RNA 适配体和 AuNPs 可视化检测 MG 的原理图。为了证实实验原理，对 AuNPs 在不同条件下的状态进行了 TEM 表征，结果如图 2-3 所示。图 2-3 (A) 结果表明，制得的 AuNPs 粒径约为 13 nm，分散性良好，这可能是由于柠檬酸盐负电荷的稳定作用[82]。在 AuNPs 溶液中加入 NaCl 时，由于盐可以屏蔽带负电粒子的静电稳定作用[83]，AuNPs 会发生聚集，如图 2-3 (D) TEM 图证实了 NaCl 存在时 AuNPs 为聚集状态。在该溶液中加入 MG-RNA 适配体后

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