细胞周期因子Geminin对CRISPR/Cas9编辑效率的影响

发布时间：2024-05-20 03:01

　　[目的]旨在探究细胞周期因子Geminin对Cas9在细胞基因组中的编辑效率是否有影响。[方法]将Geminin的前40个氨基酸序列对应的cDNA序列克隆到含靶向COSMC基因的sgRNA的pX459质粒pX459-COSMC-Cas9(wtCas9)上得到能在Cas9蛋白N端融合表达Geminin片段的pX459-COSMC-Geminin-Cas9质粒(Geminin-Cas9)。在人胚胎肾细胞HEK293T或人结肠癌细胞HT29细胞中同时表达wtCas9和Geminin-Cas9蛋白质,检测并比较细胞中Cas9的表达水平和Cas9编辑COSMC基因的效率。[结果]Western Blotting检测发现相比wtCas9质粒,转染Geminin-Cas9质粒的细胞中Cas9表达水平更低,Geminin-Cas9载体对COSMC基因的编辑效率在编辑前期也相对较低,但随着编辑时间的延长,两者的编辑效率趋于一致。[结论]细胞周期因子Geminin的存在能降低Cas9在细胞中的总体表达水平,在编辑前期会在一定程度上降低Cas9的编辑效率,而延长编辑时间又能消除这一影响。

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【部分图文】：

图1编辑细胞基因组中COSMC基因的过程示意图

将HEK293T细胞种在12孔板中，在细胞融合度达到60～70%时同时瞬时转染等量的wtCas9和Geminin-Cas9质粒(具体操作按Lipo3000转染试剂说明书)，转染24h后将培养基换成带有2.5μg/mL嘌呤霉素的培养基，筛选48h后将细胞传代除去死去的细胞。在....

图2Geminin-Cas9质粒的构建

在HEK293T细胞和HT29细胞中同时瞬时转染等量的wtCas9和Geminin-Cas9质粒，转染24h后加入终浓度5μg/mL或10μg/mL的cycloheximide(CHX)，在不同时间收集细胞样品，通过WesternBlotting方法去检测Cas9蛋白质在....

图3wtCas9和Geminin-Cas9在细胞中Cas9表达水平的比较

在HEK293T细胞中瞬时转染同等量的wtCas9和Geminin-Cas9质粒后，在不同时间收集细胞提取基因组DNA检测并比较其编辑效率。收集细胞提取细胞基因组后，通过基因组PCR扩增得到包含靶序列的一段COSMC基因片段(图4A)，将PCR产物送测序。从测序结果图可见，与sg....

图4wtCas9和Geminin-Cas9在细胞中编辑效率的比较

将测序文件放入TIDE网站测得Cas9在不同时间点对COSMC基因的编辑效率，结果表明在HEK293T细胞中，在前面几天Geminin-Cas9的编辑效率比wtCas9更低，但随着时间的推移，两者的编辑效率均逐渐升高，到传代后4d左右编辑效率会基本持平(图4D)。这可能是由于....

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