根癌农杆菌介导的千年桐SAD基因对产油酵母的遗传转化

发布时间：2020-05-12 02:59

【摘要】： 微生物油质资源的开发利用是解决能源危机的重要新途径之一。但微生物生产油脂成分复杂,难以满足生物柴油对长链单不饱和脂肪酸的要求。植物中的△9硬脂酰-ACP脱饱和酶(Stearoyl-ACP desaturase,SAD)催化在第9-10碳原子之间脱氢形成脂肪酸的第一个双键,直接决定植物储脂中不饱和脂肪酸的比例。近年来随着分子生物学技术的发展,利用外源基因调控生物代谢的研究受到关注,这无疑为产油菌种改良,指明了一个新的途径。本实验室克隆到了优良油料树种千年桐的SAD基因,并构建了该基因的真菌表达载体pCAM2300-sad,期望通过将其导入产油真菌,调控其油脂代谢途径来提高产油菌油脂品质。本实验利用农杆菌介导法,对产油酵母浅白隐球酵母进行了遗传转化,并对农杆菌菌株,农杆菌及酵母农浓度,共培养时间,共培养期AS浓度等影响转化效率的关键因子进行了优化。结果表明:利用农杆菌菌株AGL-1介导,农杆菌浓度为1×109个细胞/mL,酵母浓度为5×106至1×107个细胞/mL,在含有AS 200μmol/L条件下共培养48 h可获得较高的转化率。PCR及RT-PCR检测表明,SAD基因已成功转入浅白隐球酵母中,并能在浅白隐球酵母受体中转录成mRNA。对转基因菌株进行摇瓶发酵,测定生物量及油脂含量,得到油脂产量高于对照的菌株一株,编号E-2,其油脂产量为1.74 g/L,油脂含量为16.19g/L,分别提高了14.47%和9.39%。对9个转化子油脂脂肪酸组成进行气相色谱分析,油酸含量差距显著,其中有3株油酸比例高于对照,2株低于对照,4株变化不明显。其中X-1油酸比例最高,比对照提高了14.4%,同时棕榈酸比例下降了18.75%。同时本实验中对载体pCAM2300-sad进行改造,构建了含Zeocin筛选标记基因的载体pCAM2300-sadz,并用农杆菌介导法对优良产油酵母斯达氏油脂酵母进行了遗传转化,初步获得了一些转化子。本文通过农杆菌介导法实现了SAD基因对浅白隐球酵母和胶粘红酵母中的遗传转化,并获得了转化菌株;通过气相色谱对浅白隐球酵母转化子油脂成分分析,最终筛选到了产油性能优良的转基因菌株;对农杆菌介导浅白隐球酵母的转化条件进行了优化,初步建立了农杆菌介导的产油真菌遗传转化体系,为进一步研究打下了基础。
【图文】：

农杆菌,载体,表达载体

图 3-6 载体 pCAM2033-sadz 转化农杆菌 AGL-1-6 Transformation of pCAM2300-sadz to Agrobacterium图 3-7 表达载体转化农杆菌 PCR 及酶切鉴定.3-7 PCR and Digestion identification of expression vect(a) M. DNA 分子量标准；1-4.农杆菌质粒 PCR 产物M 1 bp2000→1000→100 →2 3 4

农杆菌,表达载体,酶切鉴定

.3.4 农杆菌 Ti 质粒转化胶粘红酵母共培养后，用 10 mL 无菌水将微孔滤膜上的菌体冲洗下来，吸取 50 μL 涂布于 SM养基上，培养 3-5d 能清晰的看到转化子菌落（如图 3-8）。挑取长势较好的菌落于 YPD体培养基中振荡培养 24 h，玻璃珠法提取 DNA，SAD 基因 PCR 检测结果如 3-9，部分化子在阳性对照相同的位置有清晰条带，，说明表达载体已经转入这些菌株中。图 3-7 表达载体转化农杆菌 PCR 及酶切鉴定Fig.3-7 PCR and Digestion identification of expression vector(a) M. DNA 分子量标准；1-4.农杆菌质粒 PCR 产物(b) M. DNA 分子量标准； 1-4. AGL-1 质粒酶切产物(a) M. DNA Marker; 1-4. PCR products of Agrobacterium vector(b) M. DNA Marker; 1-4.Digestion identification of Agrobacterium vector
【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：S216.3;Q789

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