两个耐砷菌新种的多相分类学研究与功能基因组分析

发布时间：2020-11-13 06:35

　　 江汉平原高砷沉积物具有特殊的地球化学特征,生活在其中的微生物在漫长的进化过程中,形成了一套独特的适应机制,目前对这类微生物种质资源报道较少;同时相关微生物的耐砷机制和氮素代谢功能也知之甚少。为了解决这一问题,我们利用富集培养和对微生物16S rRNA基因随机测序的方法,成功发现两株耐高砷微生物新种26-35~T和CB3~T。本课题开展了对这两个微生物新种的多相分类学研究和功能基因组分析。菌株26-35~T经扫描电镜观察,细胞为6-12μm的杆状,细菌严格需氧;PCR扩增菌株16S rRNA基因,与EzBioCloud数据库比对后发现,其与Luteimonas terricola CGMCC 1.8985~T的16S rRNA基因同源性最高,为96.7%,经MEGA 7.0软件进行系统发育进化树分析,发现26-35~T与Luteimonas属细菌聚成一类。使用气相色谱技术分析26-35~T及Luteimonas属参考菌L.terricola CGMCC 1.8985~T全细胞脂肪酸,发现它们主要的细胞脂肪酸类型为iso-C_(15:0)、iso-C_(16:0)、iso-C_(17:0)、iso-C_(11:0)、iso-C_(11:0) 3-OH和iso-C_(17:1)ω9c,但其含量在两菌之间有明显差异;使用高压液相色谱法鉴定呼吸醌,26-35~T主要含Q-8;标准双向电泳层析技术检测发现,26-35~T与本属标准菌株主要的极性脂质均为二磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油,但26-35~T还含有2种未鉴定氨基脂质和1种未鉴定磷脂;利用高效液相色谱检测发现,26-35~T基因组DNA的G+C含量为71.4 mol%。26-35~T与其它参考菌均具有氧化酶、碱性磷酸酶和萘酚-AS-BI磷酸水解酶活性,但是不具有α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、α-岩藻糖苷酶和尿素酶活性,不能利用柠檬酸三钠、L-丙氨酸和D-甘露醇生长。在水解明胶、淀粉、酪氨酸、ONPG和酪蛋白等方面,26-35~T与参考菌株表现出明显差异。26-35~T可以微弱水解柠檬酸七叶素铁,不能产生吲哚、H_2S;可以产生过氧化氢酶和细胞色素氧化酶,但是不能产生精氨酸二水解酶、赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶。26-35~T可以同化N-乙酰基-葡糖胺、L-阿拉伯糖;可以微弱利用衣康酸、丙二酸钠、L-组氨酸和2-酮葡萄糖酸钾生长。细菌同时具有碱性磷酸酶、酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、亮氨酸芳基酰胺酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶和β-葡萄糖苷酶活性,但不具有类脂酶(C14)、缬氨酸芳酰胺酶、胱氨酸芳酰胺酶、α-胰凝乳蛋白酶、β-葡萄糖醛酸酶、α-葡萄糖苷酶和N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性。该菌株对氯霉素和万古霉素具有抗性,但对氨苄青霉素和羧苄青霉素敏感。综合以上特点,26-35~T与Luteimonas属参考菌株在遗传标记、细胞化学组成以及生理生化活性等方面,既有相似性又有一定程度的差异,将26-35~T归类为Luteimonas属的一个新种,将其命名为Luteimonas arsenica,模式株为26-35~T(=CCTCC AB 2014326~T=KCTC 42824~T)。菌株CB3~T经透射电镜观察,细胞为约1-2μm的球或杆状,16S rRNA基因序列与Pseudaminobacter属Pseudaminobacter defluvii THI 051~T同源性最高,为97.8%,系统发育进化树分析显示CB3~T与Pseudaminobacter属聚为一类。CB3~T的16S rRNA基因与两株属内标准菌株P.defluvii THI 051~T和P.salicylatoxidans BN12~T同源性超过97%,进行进一步基因组DNA-DNA杂交分析后,表明CB3~T与两株标准菌株基因组DNA-DNA杂交值均小于70%,证实了CB3~T作为Pseudaminobacter属内一个新的微生物种的分类学地位;经过气相色谱分析,发现CB3~T菌株与另外3株Pseudaminobacter属参考菌的主要脂肪酸种类一致,为C_(16:0)、cyclo-C_(19:0)ω8c和summed feature 8(C_(18:1)ω7c and/or C_(18:1)ω6c),但CB3~T含有更高含量的summed feature 8,更低含量的cyclo-C_(19:0)ω8c,并且不含有iso-C_(15:0) 3-OH、C_(19:0)和C_(20:2)ω6,9c;使用高压液相色谱法鉴定呼吸醌,发现CB3~T含有的主要醌型为泛醌Q-10;标准双向电泳层析技术检测CB3~T菌株的极性脂类型发现,主要由磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰二甲基乙醇胺、磷脂酰单甲基乙醇胺、磷脂酰乙醇胺和二磷脂酰甘油胺组成,与Pseudaminobacter属其他标准菌株极性脂类型保持一致,但含量有细微差异。CB3~T基因组的G+C含量为61.4%,也处在Pseudaminobacter属细菌G+C含量的范围内。另外CB3~T和Pseudaminobacter属的参考菌具有许多相似的生理生化特征,如均具有过氧化氢酶、氧化酶、酪蛋白水解酶、亮氨酸芳酰胺酶、磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、胰蛋白酶活性,不具有脂肪酶(C14)、α-胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-β-葡萄糖胺酶、α-甘露糖苷酶、β-岩藻糖苷酶活性;可利用N-乙酰氨基葡萄糖、乳酸、L-丙氨酸、L-组氨酸、3-羟基丁酸、L-脯氨酸、D-葡萄糖和D-甘露醇生长,不可利用D-蔗糖、衣康酸、亚油酸、丙二酸钠和蜜二糖生长;吲哚产生试验、甲基红试验、Voges-Proskauer试验、明胶和DNA水解试验呈阴性;但是CB3~T也有一些独特的代谢途径,如可以利用糖原但不可以利用丙酸生长等。综合以上特点,CB3~T与Pseudaminobacter属参考菌株在遗传标记、细胞化学组成以及生理生化活性等方面,具有主要分类指标的相似性,但也在一些代谢特点中存在差异,这些特征将CB3~T与密切相关的同属物种区分开来,因此确定CB3~T是Pseudaminobacter属的一个新种,命名为Pseudaminobacter arsenicus,模式株为CB3~T(=CCTCC AB2016116~T=KCTC52625~T)。本研究还发现Pseudaminobacter arsenicus CB3~T在厌氧条件下同时具有异化还原硝酸根产铵和反硝化产氮气的能力,并且体系中碳氮比越高越有利于反硝化作用,而As(V)则对这一过程产生抑制;并通过进一步的功能基因组分析,研究了其耐高砷与硝酸盐异化还原产铵和反硝化产氮气的分子基础,发现CB3~T除了具有三个抗砷操纵子,还使用两种类型的细胞内砷还原酶,同时还具有多个As()排出蛋白,推测是其产生高砷耐受性的分子机制。另外发现其基因组中除了NO还原酶Nor外,含有硝酸盐还原酶(Nap),亚硝酸盐还原酶(Nir)以及氧化亚氮还原酶(Nos),基本存在较为完整的反硝化基因系统,但没有发现异化还原为铵的关键基因nrfA与nirB,说明细菌可能使用其它未知的代谢通路进行异化硝酸盐还原为铵反应,具有这一性质的耐高砷细菌还未见报道。本研究同时分析了P.arsenicus CB3~T所在的Phyllobacteriaceae科中180株细菌的砷代谢相关基因分布以及砷抗性基因操纵子结构,发现Phyllobacteriaceae科具有非常特别的砷抗性操纵子结构,与其它耐砷细菌主要使用ArsB作为As()外排蛋白相比,该科细菌主要使用ACR3、AqpS与ArsK三种外排蛋白解毒。本研究分离得到的P.arsenicus CB3~T与同科细菌相比,含有较多砷代谢相关基因,说明细菌砷代谢基因多样性与分离环境有密切关系。本项研究不仅丰富了耐砷细菌的种质资源,同时有助于深刻理解高砷条件下微生物的耐砷与代谢途径,并为进一步研究其机制提供了材料。
【学位单位】：中国地质大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：X172;X50
【文章目录】：
作者简历
摘要
abstract
第一章 耐砷环境微生物研究概况
    1.1 环境砷污染及其对人类健康的危害
    1.2 耐砷微生物催化的砷的地球化学循环
        1.2.1 砷的抗性还原
        1.2.2 砷的呼吸性还原
        1.2.3 砷的氧化
        1.2.4 砷的甲基化
        1.2.5 耐砷微生物参与其它地球化学因子代谢
    1.3 细菌多相分类学
        1.3.1 多相分类学
        1.3.2 耐砷微生物系统进化研究
    1.4 微生物砷代谢与硝酸盐还原关系研究现状
    1.5 研究目的与技术路线
        1.5.1 研究目的
        1.5.2 技术路线
第二章 两株耐砷菌的多相分类学研究
    2.1 前言
    2.2 材料
        2.2.1 样品与菌株
        2.2.2 培养基
        2.2.3 试剂
        2.2.4 主要仪器
        2.2.5 主要使用软件
    2.3 方法
        2.3.1 细菌的分离纯化
        2.3.2 细菌的保藏
        2.3.3 细菌形态学观察
        2.3.4 细菌基因型特征分析
        2.3.5 细菌生理生化特征分析
        2.3.6 细菌化学组分分析
    2.4 结果与分析
T的多相分类学讨论'>        2.4.1 菌株26-35^T的多相分类学讨论
T的多相分类学讨论'>        2.4.2 菌株CB3^T的多相分类学讨论
    2.5 本章结论
T特殊代谢功能研究'>第三章 耐砷菌Pseudaminobacter arsenicus CB3^T特殊代谢功能研究
    3.1 前言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 主要菌株
        3.2.2 主要试剂与仪器
        3.2.3 细菌抗砷性研究
        3.2.4 细菌硝酸盐还原功能研究
        3.2.5 抗性耐砷菌对毒砂矿（Arsenopyrite）砷释放影响
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 细菌抗砷性研究
        3.3.2 细菌硝酸盐还原功能研究
        3.3.3 抗性耐砷菌对毒砂矿（Arsenopyrite）砷释放影响
    3.4 本章小结
T功能基因组研究'>第四章 耐砷菌Pseudaminobacter arsenicus CB3^T功能基因组研究
    4.1 前言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 细菌菌株
        4.2.2 细菌基因组提取
        4.2.3 基因组测序组装
        4.2.4 基因组功能基因注释
        4.2.5 基因组功能基因分析
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 全基因组特征
        4.3.2 全基因组注释
        4.3.3 菌株全基因组圈图
        4.3.4 抗砷相关基因分析
        4.3.5 硝酸盐还原相关基因分析
    4.4 本章小结
第五章 Phyllobacteriaceae科内细菌砷相关基因的多样性研究
    5.1 前言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 基因组序列提取与功能注释
        5.2.2 基因组保守蛋白的系统进化发育分析
        5.2.3 砷相关基因注释
        5.2.4 砷相关基因的热图分析
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 Phyllobacteriaceae科细菌基因组的总结
        5.3.2 Phyllobacteriaceae科菌基因组中砷相关基因的总体分布
        5.3.3 Phyllobacteriaceae科细菌基因组中类ars基因分布与结构
        5.3.4 Phyllobacteriaceae科细菌基因组中类aio和 arr基因的分布
        5.3.5 栖息地影响砷相关基因的分布
    5.4 本章小结
第六章 总结与展望
论文创新点
致谢
附录
参考文献


本文编号：2881865