产漆酶茶叶内生真菌的筛

发布时间：2017-05-02 09:12

本文关键词：产漆酶茶叶内生真菌的筛选、酶的分离纯化及酶学特性的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：漆酶是一类含铜多酚氧化酶,催化氧化不同种类型的底物已达200余种,广泛应用于食品工业、废水处理、造纸工业、环境监测等领域。本论文是从茶叶内生真菌筛选产漆酶的菌株,分析不同营养因素和培养条件对真菌产漆酶的影响,并优化培养基成分和培养条件；在此基础上,分离纯化漆酶,分析粗酶液对茶多酚的生物转化效果。采用6种显色底物的平板初筛和酶活性测定的复筛方法,从15株茶叶内生真菌菌株中筛选获得1株产漆酶酶活较高的菌株CSN-4。分析不同营养因素和培养条件对菌株漆酶酶活力的影响,以及培养基成分和培养条件的正交试验,获得到菌株CSN-4最适液态发酵培养基组成为：麸皮30.0 g/L、蛋白胨2.25 g/L、KH2PO4 2.0 g/L、MgSO4 ·7H2O 0.2 g/L、MnSO4 ·5H2O 0.5 g/L、 CuSO4·5H2O 0.0175 g/L、茶水6g/L。最佳的发酵条件为：接种量为6个菌饼(直径为6 mm),装液量60 mL/250 mL,pH(4.8)自然,转速120 r/min,温度28℃。通过硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素阴离子层析和葡聚糖G-150凝胶层析等方法分离纯化漆酶,纯化倍数为8.98,回收率为24.88%,漆酶相对分子质量约为70 kDa。对纯化后的漆酶酶学性质进行研究,漆酶的最适温度为60℃,最适pH 4.0,漆酶在35℃以下保温1h,仍能保存95%以上的酶活,在温度大于50℃保温1h,剩余酶活在60%以下,该漆酶在高温条件下,热稳定性比较差。漆酶在25℃条件下pH4-6保持4 h,酶活保持在96%以上,在pH大于8条件下保持4h,剩余酶活在26%以下,此漆酶在酸性条件下更稳定。低浓度Cu2+对漆酶酶活有促进作用,当Cu2+浓度大于5 mmol/L时,对漆酶具有一定抑制作用。初步研究了漆酶对茶多酚的转化效果,分光光度计法和HPLC检测的结果显示,漆酶粗酶液对茶多酚溶液转化效果明显,转化后儿茶素EC、ECG这两种物质含量下降,分别下降了17.28%和28.6%,而EGCG这种物质的含量明显变多,增加量达到81.04%。平板筛选得到产漆酶的内生真菌CSN-4,经过培养基和培养条件优化后,漆酶酶活提高了约24倍。菌株CSN-4液体发酵产生的漆酶能使茶多酚溶液发生转化。
【关键词】：茶叶 内生真菌 漆酶 培养条件 发酵优化 分离纯化 酶学性质 茶多酚
【学位授予单位】：福建师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q936
【目录】：

中文摘要2-3
Abstract3-5
中文文摘5-12
第一章绪论12-26
1 茶叶概述12
1.1 中国茶叶资源现状12
1.2 茶叶的生物活性成分12
2 植物内生真菌12-13
2.1 内生真菌的多样性12-13
2.2 内生真菌代谢产物的多样性13
3 漆酶概述13-19
3.1 漆酶的介绍13-14
3.2 漆酶的来源14-17
3.3 漆酶的发酵生产17-18
3.4 漆酶酶活测定18
3.5 漆酶的分离纯化18-19
4 漆酶的应用19-21
4.1 环境保护中的应用19
4.2 工业中的应用19-20
4.3 食品工业中的应用20
4.4 生物检测中的应用20
4.5 医药中的应用20
4.6 对茶多酚转化的应用20-21
5 茶多酚的介绍21-22
6 本课题研究的内容和意义22-26
6.1 主要内容及技术路线22-23
6.2 研究意义23-26
第二章产漆酶茶叶内生真菌的筛选26-34
1 前言26
2 材料与方法26-32
2.1 材料26-27
2.1.1 供试菌株26
2.1.2 培养基26-27
2.1.3 主要试剂27
2.1.4 主要仪器设备27
2.1.5 茶水浸提液制备27
2.2 方法27-29
2.2.1 菌种活化28
2.2.2 漆酶酶活测定28
2.2.3 产漆酶菌株平板初筛28
2.2.4 产漆酶菌株摇瓶复筛28-29
2.3 结果与分析29-32
2.3.1 平板初筛29-31
2.3.2 摇瓶复筛31-32
2.3.3 菌株CSN-4发酵产酶曲线32
3 小结与讨论32-34
第三章菌株CSN-4产漆酶培养基及培养条件研究34-48
1 前言34
2 材料与方法34-37
2.1 材料34-35
2.1.1 供试菌株34
2.1.2 培养基34
2.1.3 主要试剂34-35
2.1.4 主要仪器设备35
2.2 方法35-37
2.2.1 漆酶活力测定35
2.2.2 不同营养成分对菌株CSN-4产漆酶酶活的影响35-36
2.2.3 不同培养条件对菌株CSN-4菌株产漆酶酶活的影响36
2.2.4 正交试验36-37
2.2.5 数据处理37
3 结果与分析37-45
3.1 不同C源物质对菌株CSN-4漆酶酶活的影响37
3.2 麸皮用量对菌株CSN-4漆酶酶活的影响37-38
3.3 不同N源物质对菌株CSN-4漆酶酶活的影响38
3.4 蛋白胨加入量对菌株CSN-4漆酶酶活的影响38-39
3.5 茶水浓度对菌株CSN-4漆酶酶活的影响39
3.6 CuSO_4加入量对菌株CSN-4漆酶酶活的影响39-40
3.7 培养基成分的正交试验40-41
3.8 不同装液量对菌株CSN-4漆酶酶活的影响41-42
3.9 不同接菌量对菌株CSN-4漆酶酶活的影响42
3.10 培养基初始pH对菌株CSN-4漆酶酶活的影响42-43
3.11 培养温度对菌株CSN-4漆酶酶活的影响43
3.12 不同摇床转速对菌株CSN-4漆酶酶活的影响43-44
3.13 培养条件的正交试验优化44-45
4 小结与讨论45-48
第四章菌株CSN-4漆酶分离纯化及酶学性质的研究48-64
1 前言48
2 材料和方法48-54
2.1 材料48-50
2.1.1 菌株及培养48
2.1.2 主要试剂48-49
2.1.3 主要仪器49
2.1.4 试剂配制49-50
2.2 方法50-54
2.2.1 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳50-51
2.2.2 蛋白含量的测定51
2.2.3 漆酶的分离纯化51-53
2.2.3.1 硫酸铵饱和度的确定51-52
2.2.3.2 酶粗液硫酸铵分级沉淀52
2.2.3.3 DEAE-纤维素阴离子交换柱层析52
2.2.3.4 葡聚糖G-150凝胶层析52-53
2.2.3.5 SDS-PAGE凝胶电泳53
2.2.3.6 纯化倍数及回收率的计算53
2.2.4 漆酶酶学性质的研究53-54
2.2.4.1 最适反应温度53
2.2.4.2 最适反应pH53
2.2.4.3 漆酶的热稳定性53
2.2.4.4 漆酶的酸碱稳定性53-54
2.2.4.5 Cu~(2+)对酶活性的影响54
3 结果与分析54-61
3.1 漆酶的分离纯化54-59
3.1.1 粗酶液阶段54
3.1.2 硫酸铵分级沉淀的确定54-55
3.1.3 酶粗液硫酸铵分级沉淀55
3.1.4 DEAE-纤维素阴离子交换柱层析55-56
3.1.5 葡聚糖G-150凝胶层析56-57
3.1.6 漆酶各步纯化结果及纯度鉴定57-59
3.2 漆酶酶学性质59-61
3.2.1 最适反应温度59
3.2.2 最适反应pH59-60
3.2.3 漆酶的热稳定性60
3.2.4 漆酶的酸碱稳定性60
3.2.5 Cu~(2+)对酶活性的影响60-61
4 小结与讨论61-64
第五章漆酶转化茶多酚的初步研究64-74
1 前言64
2 材料与方法64-65
2.0 漆酶64
2.1 主要试剂和仪器64
2.2 方法64-65
2.2.1 漆酶对茶多酚溶液生物转化65
2.2.2 转化产物的HPLC分析65
3 结果与分析65-71
3.1 酶液量对茶多酚溶液生物转化的影响65-67
3.2 反应时间对茶多酚溶液生物转化的影响67-68
3.3 转化产物的HPLC分析68-71
3.3.1 标样和空白对照的HPLC分析68-69
3.3.2 粗酶和纯酶对茶多酚转化后的HPLC分析69-71
4 小结与讨论71-74
第六章结论与展望74-76
1 结论74-75
2 展望75-76
参考文献76-84
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果84-86
致谢86-88
个人简历88-92

【参考文献】

中国期刊全文数据库前10条

1 宛晓春;李大祥;张正竹;夏涛;凌铁军;陈琪;;茶叶生物化学研究进展[J];茶叶科学;2015年01期

2 黄磊;杨军国;付杰;夏小欢;裘s

本文编号：340675

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