羊骨胶原肽—钙螯合物的酶解—发酵法制备及其结构表征和相关性质分析

发布时间：2020-11-07 13:40

　　 本研究以羊骨粉为原料制备羊骨胶原多肽-钙螯合物。以游离钙含量为指标,通过单因素试验和响应面试验优化的方法筛选出酶解效果最好的两种酶,进行顺序酶解;所得酶解液继续用乳酸菌进行发酵,优化发酵条件;在此基础上对羊骨自身的骨钙和多肽在一定条件下进行螯合,无水乙醇沉淀获得胶原多肽-钙螯合物,并对其结构表征和相关性质进行分析研究。结果如下:(1)筛选最优酶:三种酶(木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶)水解提取羊骨中可溶性钙的最佳工艺条件分别为:酶解温度55℃、40℃、45℃;酶解时间4 h、4 h、5 h;酶解pH 6.0、2.5、7;加酶量5000 U/g、5300 U/g、1500 U/g。平行3次,得到的游离钙含量分别达到78.30 mg/100g、1008.68 mg/100g、45.68 mg/100g。因此,最后选择木瓜蛋白酶和胃蛋白酶进行后续试验。(2)最优两种蛋白酶的酶解组合为:在两种酶各自最优酶解温度、酶解pH、加酶量条件下,先木瓜蛋白酶酶解3 h,后胃蛋白酶继续酶解3 h,最终得到的游离钙含量最高,可达到1839.14 mg/100g。(3)酶解液发酵的最佳工艺条件:葡萄糖添加量3%、接种量6%、发酵时间24.5h、发酵温度37℃和初始pH6.5,其游离钙含量达到2212.58 mg/100g。(4)钙螯合能力为42.57±0.09%;肽-钙螯合物中钙含量为15.81%±0.06%。(5)紫外吸收光谱分析发现胶原多肽和钙螯合后形成螯合物;荧光光谱的变化表明螯合反应可能是侧链残基和Ca~(2+)相互作用所引起的;傅立叶变换红外光谱推测胶原多肽的主要结合位点为肽链上的羧基、羟基、氨基,这些基团与Ca~(2+)协同形成肽-钙螯合物;DSC图谱上新吸收峰以及X衍射图谱中新衍射峰的出现都进一步证明了螯合反应的发生;氨基酸分析表明通过氨基酸的残基羧基在反应过程中结合钙;SEM也同样表明在螯合过程中,由于肽和钙离子之间的相互作用而改变了肽的初始结构。(6)对肽-钙螯合物进行稳定性研究:肽-钙螯合物在不同温度环境下相对稳定;在不同pH环境下,相对于酸性环境,中性和碱性环境下肽-钙螯合物更稳定。(7)对肽-钙螯合物进行体外消化研究:用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胃+胰蛋白酶消化后,相对于对照,肽-钙螯合物的钙含量分别降低(P0.05)至87.3±2.3%,73.5±4.2%和57.6±3.8%。结果表明,肽-钙螯合物在胃肠道环境中稳定,可以促进钙的吸收。(8)对肽-钙螯合物抗氧化性做了初步研究:相比胶原多肽来说,肽-钙螯合物的抗氧化活性提高。本试验旨在为羊骨的高值利用和相关产品开发奠定基础,发掘其潜在的应用价值。
【学位单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：TS251.94;TQ920.6
【部分图文】：

甘肃农业大学2020届硕士学位论文2扫描电镜下观察，发现它的结晶体积小，密度大，是呈现柱状结构的，由于其表面积大，因此更加有利于钙磷元素在骨组织中的交换运输速度的加快[10]。图1-1羟基磷灰石阳离子Fig.1-1Hydroxyapatitecation2.骨钙的提取方法2.1酸解法酸解法是利用一些强酸来破坏骨胶原的原本的高级结构，将其中的Ca10(PO)6(OH)2分解出来，再进一步溶解获得钙离子。我们注意到用酸解法提取时，骨钙被溶出来的同时，骨中的一些其他有毒有害的矿物元素也会溶出，比如铅、砷、汞等重金属元素，这些都对人体不利。另外，酸解法获得的磷酸盐一般溶解度并不高，因此它的有效吸收和利用通常要在偏酸性的条件下进行，小肠是人机体主要吸收和利用钙的位置，它呈中性[11]。目前关于酸解法提取骨钙的报道中发现，酸解以后的产物盐含量高，颜色普遍偏深[12]，影响进一步的开发利用。2.2碱解法碱解法对骨胶原的破坏是很大的，能够得到含量很高的Ca和P，但是由于破坏程度很大，骨胶原蛋白的损失也很大，不利于蛋白的吸收利用；同时在人体吸收的过程中会很容易和草酸等反应生成不溶性的物质，可能会导致出现结石。碱解法的水解产物也是盐含量高，颜色较深[13]。

甘肃农业大学2020届硕士学位论文6胞的其他支路来发挥作用，钙离子也就通过这些支路被吸收利用，在这一过程维生素D是起到一定的促进作用的[40-41]。因此，钙离子浓度的高低决定了它利用的方式，低浓度的情况主要发生位置在细胞内，借助肠道内的上皮细胞来实现钙离子的吸收；高浓度的情况主要发生位置在细胞以外的地方，主要是各种细胞支路来实现钙离子的吸收。图1-2人体内钙的吸收代谢途径Fig.1-2Calciumabsorptionandmetabolisminhumanbody4.4钙制剂的发展现状下表为目前钙制剂的发展状态以及在各阶段代表产品和产品的优缺点如表1-1所示[42-47]。表1-1钙制剂的发展现状Table1-1Developmentstatusofcalciumpreparations钙制剂代表性产品优点缺点第一代产品以无机盐为主，碳酸钙，乳酸钙和氯化钙；动物鲜骨等含钙量高不溶于水，必须经胃酸消化后才能吸收，对胃有强烈的刺激性；碱性胃肠环境中易于形成钙沉淀，容易停留在肾脏，引起肾结石或直接被排泄掉，吸收率低，存在毒副作用

甘肃农业大学2020届硕士学位论文243.结果与分析3.1木瓜蛋白酶酶解羊骨粉的研究3.1.1pH对游离钙含量的影响图3-1酶解pH对游离钙含量的影响Fig.3-1EffectofEnzymaticpHonFreeCalciumContent注：同一系列的不同字母表示差异性显著（下同）根据图3-1可看出酶解pH在5.5-6的范围内，游离钙含量与pH是呈正相关的，当木瓜蛋白酶的酶解pH为6时，游离钙含量达到最高61.854mg/100g，较酶解pH在5.5、7.5时分别提高了20.70%、38.78%（P＜0.01），因为pH为6时，木瓜蛋白酶的活性位点暴露出来的更多，这样能够增加有效的酶活力，酶解效果也就更好。游离钙含量再随着pH增大呈降低的趋势，主要因为酶对反应环境有一定的pH敏感性[119]，酶的空间构象会随着pH的作用发生改变，当pH超过6时，酶与蛋白质之间的解离状态受到了影响[120]，酶解效果也就下降。所以选择pH为6进行后续试验研究。3.1.2温度对游离钙含量的影响
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本文编号：2874023