大肠杆菌硝基还原酶NfsB的分子改造及其催化特性

发布时间：2017-03-17 19:07

  本文关键词：大肠杆菌硝基还原酶NfsB的分子改造及其催化特性，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：硝基还原酶是一类分布广泛的黄素蛋白酶,与辅基FMN或FAD分子结合,以NAD(P)H作为电子供体催化硝基基团生成相应的羟胺或氨基基团。因此,该类酶在污染物环境修复、芳香羟胺类药物中间体的生物合成和癌症前药激活等诸多领域具有重要应用价值。本论文以大肠杆菌硝基还原酶NfsB作为研究对象,以环境污染物2,4,6-三硝基甲苯(TNT)、芳香羟胺合成原料2,4-二硝基甲苯(2,4-DNT)和癌症治疗前药CB1954作为底物,利用HPLC 、MS和酶动力学等方法分析NfsB催化不同硝基化合物还原的产物、催化活性及区位选择性。结合定点突变、结晶学和分子对接模拟等手段探讨了NfsB催化活性和区位选择性的结构基础,并改造获得催化活性或区位选择性更好的突变体酶。本论文主要结果如下：(1) NfsA和NfsB对TNT表现出类似的催化活性,经HPLC-MS产物分析表明二者催化TNT还原生成2,4-二羟胺-6-硝基甲苯(2,4-DHANT)的途径相同。当氧气存在时,TNT还原过程中的4-羟胺-2,6-二硝基甲苯(4-HADNT)和亚硝基中间产物可缩合生成相应的氧化偶氮化合物。基因定点突变研究表明,残基F123对酶催化活性影响较大。突变体F123A对污染物TNT及其氨基衍生物2-氨基-4,6-二硝基甲苯(2-ADNT)和4-氨基-2,6-二基甲苯(4-ADNT)的催化活性较野生型酶分别提高了1.4倍、3.6倍和4.0倍。(2)基因改造NfsB实现对2,4-DNT的区位选择性还原的改变。野生型NfsB能够专一性还原2,4-DNT的4位硝基。为了获得2位硝基的还原活性,对可能影响区位选择性的位点(T41、F70、N71和F124)进行单点突变和组合突变。三突变体T41L/N71S/F124W可以实现2,4-DNT的2位硝基还原,并解析获得其晶体结构。与野生型NfsB晶体结构比较,我们发现三突变体与野生型酶在整体结构上十分相似,但在活性口袋内部存在明显的结构差异：突变体中L41能够与W124相互作用,从而在FMN异咯嗪环的上方形成一个疏水性更强的底物结合区域；F70和W124的芳环侧链朝向活性口袋外侧发生翻转,入口处较野生型酶更宽。(3)分子对接结果显示,底物2,4-DNT在野生型NfsB和突变体T41L/N71S/F124W活性口袋中结合方式完全不同。在野生型NfsB中,2,4-DNT仅呈现一种构象,即4位硝基插入由T41、E165、G166和F124形成的口袋中,在FMN的N5原子上方实现还原反应；而在突变体酶中,底物2,4-DNT采用了一种与野生型酶中完全不同的结合模式,即1位甲基与L41、W124形成疏水相互作用插入活性口袋内部,从而使其邻近的2位硝基位于FMN的N5原子上方实现还原反应。(4)为了提高NfsB对癌症前药CB1954的催化活性并实现对酶区位选择性的改变,对影响酶催化活性和区位选择性的位点(T41、N71、F123和F124)进行单点突变和组合突变。结果表明,单突变体F124W可实现对CB1954的4位硝基的专一性还原：同时突变N71或F123可与F124W协同增加催化活性,而对其区位选择性没有影响；三突变体N71S/F123A/F124W除实现对CB1954的4位硝基的专一性还原外,催化活性也较野生型酶提高了21.1倍。(5)解析获得突变体N71S/F123A/F124W的晶体结构。与已知晶体结构比较,我们发现突变体中W124较大的吲哚环可以实现与CB1954中氮杂环较强的堆积作用,使其邻近的4位硝基位于FMN的N5原子上方位置,从而实现其专一性还原；F123A突变为W124残基侧链提供了更大的活动空间,有利于催化过程中构象变化,且N71S突变使得邻近F70的芳香侧链偏转、活性口袋入口处变宽,有利于底物的进入,从而提高突变体酶对CB 1954的催化活性。
【关键词】：硝基还原酶 定点突变 大肠杆菌 2 4 6-三硝基甲苯 CB1954
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X172;O629.8
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• TABLE OF CONTENTS11-14
• 图目录14-16
• 表目录16-17
• 主要符号表17-18
• 1 文献综述18-47
• 1.1 硝基还原酶概述18-25
• 1.1.1 硝基还原酶的分类18-19
• 1.1.2 硝基还原酶的应用19-25
• 1.2 硝基还原酶的序列及结构特征25-34
• 1.2.1 细菌硝基还原酶的序列特征26-28
• 1.2.2 细菌硝基还原酶的晶体结构28-30
• 1.2.3 辅基FMN的结合和构象变化30-32
• 1.2.4 底物结合口袋的结构特征32-34
• 1.3 硝基还原酶的催化机制和关键氨基酸残基34-45
• 1.3.1 硝基还原酶的催化机制34-35
• 1.3.2 硝基还原酶的底物多样性及其分子机制35-36
• 1.3.3 硝基还原酶的区位选择性及其分子机制36-39
• 1.3.4 大肠杆菌硝基还原酶NfsB的关键氨基酸残基39-45
• 1.4 本论文的选题依据和研究内容45-47
• 1.4.1 选题依据45
• 1.4.2 研究内容45-47
• 2 NfsB催化TNT还原途径及基因改造47-69
• 2.1 引言47
• 2.2 实验材料与方法47-51
• 2.2.1 NfsA和NfsB的克隆表达及纯化47-48
• 2.2.2 TNT及其氨基衍生物的还原产物分析48-49
• 2.2.3 NfsB突变体的克隆、表达及纯化49
• 2.2.4 NfsA、NfsB及其突变体的酶催化动力学分析49-50
• 2.2.5 分子对接50-51
• 2.3 实验结果51-64
• 2.3.1 NfsB催化TNT还原产物分析51-54
• 2.3.2 NfsB催化2-ADNT和4-ADNT的还原产物分析54-56
• 2.3.3 NfsA与NfsB还原TNT的产物和催化活性比较56-57
• 2.3.4 NfsB突变位点选择57-59
• 2.3.5 NfsB突变体构建及其表达纯化59-61
• 2.3.6 NfsB突变体还原TNT及氨基衍生物的动力学分析61-64
• 2.4 分析讨论64-68
• 2.4.1 NfsA和NfsB催化TNT还原途径64-65
• 2.4.2 F123和F124对NfsB催化活性的影响65-66
• 2.4.3 F124W对2-ADNT和4-ADNT催化活性差异的分子机制66-68
• 2.5 本章小结68-69
• 3 基因改造NfsB还原2,4-DNT的区位选择性及其分子机制69-92
• 3.1 引言69
• 3.2 实验材料与方法69-74
• 3.2.1 NfsB催化2,4-DNT和2,4-DNAN的还原产物分析69-70
• 3.2.2 NfsB突变体的克隆、表达与纯化70
• 3.2.3 NfsB及其突变体还原2,4-DNT和2,4-DNAN的动力学分析70-72
• 3.2.4 蛋白的纯化及结晶前预处理72
• 3.2.5 蛋白结晶条件的筛选和优化72-73
• 3.2.6 X-射线衍射数据的收集73
• 3.2.7 晶体结构的解析和修正73
• 3.2.8 分子对接73-74
• 3.3 实验结果74-89
• 3.3.1 野生型NfsB催化2,4-DNT还原产物分析74-75
• 3.3.2 定点突变改变NfsB还原2,4-DNT的区位选择性75-79
• 3.3.3 底物取代基对NfsB区位选择性的影响79-83
• 3.3.4 NfsB及其突变体催化2,4-DNT和2,4-DNAN还原的动力学分析83
• 3.3.5 突变体T41L/N71S/F124W晶体生长、衍射数据收集和结构解析83-86
• 3.3.6 突变体T41L/N71S/F124W与野生型NfsB晶体结构比较86-87
• 3.3.7 NfsB及其突变体还原二硝基化合物的区位选择性的分子机制87-89
• 3.4 分析讨论89-90
• 3.5 本章小结90-92
• 4 基因改造NfsB还原CB1954的区位选择性及其分子机制92-104
• 4.1 引言92
• 4.2 实验材料与方法92-94
• 4.2.1 NfsB突变体的克隆、表达与纯化92
• 4.2.2 NfsB及其突变体还原CB1954的区位选择性分析92-94
• 4.2.3 NfsB及其突变体还原CB1954的催化动力学分析94
• 4.2.4 蛋白结晶、数据收集和解析94
• 4.3 实验结果94-101
• 4.3.1 野生型NfsA和NfsB催化CB1954还原产物分析94-95
• 4.3.2 残基41和124对CB1954区位选择性的影响95-96
• 4.3.3 残基41、71、123和124对CB1954催化活性的影响96-97
• 4.3.4 残基41、71、123和124的协同效应97-99
• 4.3.5 突变体N71S/F123A/F124W与野生型NfsB的晶体结构比较99-101
• 4.4 分析讨论101-102
• 4.4.1 NfsB区位选择性还原的结构基础101
• 4.4.2 关键氨基酸之间的协同效应101-102
• 4.5 本章小结102-104
• 5 结论与展望104-106
• 5.1 结论104-105
• 5.2 创新点摘要105
• 5.3 有待深入研究的内容105-106
• 参考文献106-114
• 攻读博士学位期间科研项目及科研成果114-115
• 致谢115-116
• 作者简介116

  本文关键词：大肠杆菌硝基还原酶NfsB的分子改造及其催化特性，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：253328