基于细胞芯片的表面等离子体共振成像技术及其在药物分析中的应用

发布时间：2017-03-21 01:04

  本文关键词：基于细胞芯片的表面等离子体共振成像技术及其在药物分析中的应用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在化工制药研究中,利用表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)技术评价候选药物与其作用靶点的结合性能,进而对其进行筛选是药物开发的重要步骤。作为一种光学传感方法,表面等离子体共振技术具有实时、免标记、高灵敏度等优点,但是传统的SPR应用需要先从细胞内提取、纯化目标分子,然后将其固定修饰在传感芯片表面,操作复杂,耗时费力;此外,离开了细胞环境,目标分子的化学构象及生物活性都可能发生改变,影响实验结果的准确性。因此,本文利用基于细胞芯片的表面等离子体共振成像技术(Surface Plasmon Resonance image,SPRi)原位测量细胞表面的生物化学反应。首先,本文利用基于细胞芯片的SPRi技术研究了免疫荧光试验中荧光标记分子对细胞表面生物分子结合反应的影响,说明了免标记技术在生物化学研究中的重要性。该章研究使用带正电、负电及电中性的有机荧光分子标记麦芽凝集素(Wheat Germ Agglutinin,WGA),然后分别测量免标记的WGA以及三种被标记WGA与细胞表面糖蛋白受体分子之间的结合吸附-解离脱附过程,并通过改变溶液离子浓度进一步验证荧光分子电荷的影响。结果表明:荧光标记分子的电荷性质显著影响细胞表面配体-受体(Wheat Germ Agglutinin-Glycoprotein)分子之间的结合吸附过程以配体分子在细胞表面结合位点的分布区域。这种影响主要来源于细胞膜本身所带负电荷,可以促进被正电荷荧光分子标记的配体分子与细胞表面受体分子快速结合;而细胞膜表面电荷分布不均一,也造成不同荧光分子标记的配体分子在细胞表面结合的分布区域存在差异。然后,本文通过稳定光源温度和锁定传感芯片位置,改善了实验装置信噪比,实现了原位监测单克隆抗体药物分子(Herceptin)与细胞表面受体分子(Her2)之间的动态结合过程,藉此分别测量了Herceptin分子与不同细胞系细胞以及肿瘤组织原代细胞表面Her2分子之间的键合反应。结果表明:不同细胞系细胞表面,甚至同一细胞系不同细胞表面Herceptin-Her2相互作用的结合动力学常数有明显差异,这种差异在肿瘤组织的原代细胞表面表现的更加显著。从而强调了免标记单细胞研究的结果更加准确可靠。其次,针对在临床治疗过程中,肿瘤细胞会对单克隆抗体药物分子Herceptin产生耐药性的问题,本文测定了在药物敏感和药物耐受细胞表面,Herceptin-Her2分子间反应的结合动力学曲线,并通过双通道荧光染色技术进一步解释药物分子在药物耐受细胞表面结合动力学改变的原因。实验发现:由于粘蛋白Muc4的过度表达阻碍了部分Herceptin-Her分子反应的结合位点,在药物耐受细胞表面一些Herceptin分子脱附解离速度显著增大,无法有效作用于肿瘤细胞,导致药物分子Herceptin的后期治疗失败。最后,本文利用基于细胞芯片的SPRi技术研究了新型靶向纳米药物在细胞表面的结合性能。本章实验通过Protein A分子的共轭螯合作用,制备了表面修饰不同密度靶向识别分子Herceptin的金纳米颗粒(Au NP)作为靶向纳米药物(Herceptin@Au NP),再分别测定了上述纳米药物在Her2表达浓度不同的细胞表面的动态结合过程。实验发现:靶向纳米药物(Herceptin@Au NP)表面的识别分子(Herceptin)密度以及细胞表面目标受体分子(Her2)的表达浓度都会显著影响靶向纳米颗粒在细胞表面的结合方式。纳米颗粒(Au NP)会影响识别分子(Herceptin)与受体分子(Her2)之间的结合性能,靶向纳米药物只有与受体分子(Her2)之间发生双(多)键合反应才能有效结合在细胞表面。上述结论完善了基于细胞芯片的SPRi技术,拓宽了该技术的应用范围,强调了免标记单细胞分析在生物检测及药物分析中的必要性和可靠性;同时也揭示了电荷对细胞表面生物化学反应的影响、阐明了肿瘤细胞对单克隆抗体药物产生耐药性的动力学机制、发现了影响靶向纳米颗粒在细胞表面结合性能的主要因素。这些都有助于人类进一步理解生化反应的本质、加快新型药物开发进度、提高疾病诊疗效率。
【关键词】：表面等离子体共振 细胞成像 分子相互作用 单克隆抗体 靶向纳米药物
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ460.72
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-11
• 1 绪论11-27
• 1.1 研究背景与意义11-12
• 1.2 表面等离子体共振(SPR)简介12-16
• 1.2.1 SPR仪器系统12-13
• 1.2.2 SPR定义13-14
• 1.2.3 SPR激发结构及原理14-16
• 1.3 SPR应用技术的发展16-22
• 1.3.1 传统强度检测SPR光谱技术16-18
• 1.3.2 基于微阵列芯片的SPR成像（SPRi）技术18-19
• 1.3.3 基于细胞芯片的SPRi技术19-20
• 1.3.4 基于细胞芯片的SPRi技术在生物分析中的优势20-22
• 1.4 本文内容简介22-27
• 1.4.1 研究目的22
• 1.4.2 实验装置22-24
• 1.4.3 研究内容24-27
• 2 荧光标记分子对细胞表面蛋白质分子间相互作用的影响27-39
• 2.1 本章绪论27
• 2.2 实验部分27-28
• 2.2.1 实验材料27-28
• 2.2.2 细胞培养28
• 2.2.3 仪器装置28
• 2.2.4 流控系统28
• 2.3 结果与讨论28-37
• 2.3.1 免（有）标记探针蛋白结合动力学的测量28-29
• 2.3.2 荧光标记分子的选择29-30
• 2.3.3 荧光标记分子对探针蛋白在细胞表面结合动力学的影响30-32
• 2.3.4 荧光标记分子对探针蛋白在细胞表面结合位点的影响32-35
• 2.3.5 电荷效应35-37
• 2.4 本章小结37-39
• 3 单克隆抗体药物Herceptin与细胞表面Her2 受体之间的结合动力学研究39-53
• 3.1 本章绪论39-40
• 3.2 实验部分40-42
• 3.2.1 实验材料40
• 3.2.2 细胞转染40
• 3.2.3 细胞培养40-41
• 3.2.4 免疫荧光41
• 3.2.5 仪器装置41-42
• 3.3 结果与讨论42-51
• 3.3.1 提高仪器信噪比42-43
• 3.3.2 Herceptin在SKBR3 细胞表面结合动力学研究43-46
• 3.3.3 Herceptin在不同细胞系细胞表面结合动力学研究46-50
• 3.3.4 Herceptin在原代细胞表面结合动力学研究50-51
• 3.4 本章小结51-53
• 4 肿瘤细胞对单克隆抗体药物Herceptin的耐药机制研究53-65
• 4.1 本章绪论53-54
• 4.2 实验部分54-57
• 4.2.1 实验材料54-55
• 4.2.2 耐药细胞筛选55-56
• 4.2.3 免疫荧光56-57
• 4.2.4 仪器装置57
• 4.3 结果与讨论57-63
• 4.3.1 Herceptin在药物敏感和药物耐受细胞表面结合动力学研究57-59
• 4.3.2 单细胞耐药指数测定59-61
• 4.3.3 细胞耐药机制研究61-63
• 4.4 本章小结63-65
• 5 靶向纳米颗粒在细胞表面的结合机制研究65-77
• 5.1 本章绪论65
• 5.2 实验部分65-66
• 5.2.1 实验材料65-66
• 5.2.2 制备靶向纳米颗粒 (Herceptin@AuNP)66
• 5.2.3 细胞培养66
• 5.2.4 仪器装置66
• 5.3.结果与讨论66-76
• 5.3.1 Herceptin@AuNP在SKBR3 细胞表面的结合动力学研究66-72
• 5.3.2 Herceptin@AuNP在JIMT1 细胞表面的结合动力学研究72-74
• 5.3.3 识别分子Herceptin密度对靶向纳米颗粒结合性能的影响74-76
• 5.4 本章小结76-77
• 6 结论与展望77-79
• 6.1 本文结论77-78
• 6.2 展望78-79
• 参考文献79-89
• 致谢89-91
• 附录91-95
• A．结合动力学模型91-95
• A1. 单键合模型91-93
• A2. 双组份模型93-94
• A3. 双键合模型94-95
• B．作者在攻读博士学位期间发表的论文95
• B1. 表面等离子体共振成像领域95
• B2. 其他领域论文95

【参考文献】

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 卢晋;基于表面等离子体的电化学技术在生物分析中的应用[D];清华大学;2013年

  本文关键词：基于细胞芯片的表面等离子体共振成像技术及其在药物分析中的应用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：258750