重组大肠杆菌生产核黄素和β-胡萝卜素的途径构建与改造

发布时间：2021-06-30 11:04

本研究通过核黄素合成途径的构建,中心碳代谢的改造及发酵条件的优化的策略,研究了大肠杆菌生产核黄素的代谢能力;其次,利用基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术,在大肠杆菌的基因组上整合β-胡萝卜素合成基因,对MEP途径、中心碳代谢途径进行组合改造,获得高产β-胡萝卜素的工程菌。首先,考察大肠杆菌自身核黄素合成基因在不同拷贝数质粒中表达对核黄素产量的影响,并与枯草芽孢杆菌核黄素合成基因比较。通过发酵验证,发现大肠杆菌自身核黄素合成基因在高拷贝质粒过表达更有利于核黄素的积累。5-磷酸核酮糖是核黄素合成的重要前体物。为了提高5-磷酸核酮糖的供给,本文对氧化磷酸戊糖途径、糖酵解途径以及ED途径(Entner-Doudoroff Pathway)进行了系统地研究。研究发现,过表达来源于谷氨酸棒杆菌的突变型zwf243和gnd361基因不能有效的提高核黄素产量;进一步过表达大肠杆菌Qg源pgl基因能够进一步提高核黄素的产量;敲除糖酵解途径中pgi基因构建RF02S,使得核黄素的产量提高了72.4%,进一步失活ED途径使得核黄素的产量提高41.8%;过表达acs基因能够有效的降低副产物乙酸的积累,对核黄素的产量没有明显的影响。最终获得工程菌RF05S在以10g/L葡萄糖为底物的LB培养基中能够积累585.2±13.6mg/L核黄素。为了防止过多的核黄素转化为FMN和FAD,在不影响菌体生长的情况下提高核黄素的产量,通过对催化该反应的酶基因ribF的RBS强度进行微调。获得工程菌RF05S-M40的核黄素激酶活性是出发菌株的64.8%,核黄素的产量达到1019.6±25.3mg/L。考察RF05S-M40在不同的发酵条件及发酵培养基对核黄素产量的影响。利用优化的培养基,RF05S-M40能够积累2702.8±89.9 mg/L得率137.5 mg/g glucose,是迄今为止报道的核黄素得率最高工程菌株。本文第二部分利用CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术,将β-胡萝卜素合成基因整合到基因组上,对MEP途径进行组合调控以增强IPP和DMAPP的合成,获得工程菌ZF43能够积累21.45±0.46mg/Lβ-胡萝卜素。G3P和Pyr是MEP途径的直接前体物,NADPH是β-胡萝卜素合成的重要辅因子。为了提高这些代谢物的供给,对中心碳代谢、MEP途径及β-胡萝卜素合成途径进行组合优化,获得高产β-胡萝卜素的工程菌ZF237T,高密度发酵能够获得2.02g/Lβ-胡萝卜素。首次在大肠杆菌中将CRISPR/Cas9系统成功的应用于代谢工程改造,并获得高产菌种。
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;Q936

文章目录

中文摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 引言

1.2 核黄素的概述

1.2.1 核黄素的理化性质、功能、用途及市场需求

1.2.2 核黄素的合成

1.2.3 核黄素生物合成途径及其代谢调节机制

1.2.4 产核黄素菌株构建的国内外现状

1.3 β-胡萝卜素的概述

1.3.1 β-胡萝卜素的理化性质、功能和用途

1.3.2 β-胡萝卜素合成途径

1.3.3 E.coli β-胡萝卜素生物合成研究进展

1.4 大肠杆菌基因组无痕重组技术及策略

1.4.1 λ-Red重组系统

1.4.2 归巢核酸内切酶

1.4.3 成簇间隔短回文重复(CRISPR)编辑系统

1.5 选题背景及研究内容

1.5.1 大肠杆菌核黄素产核黄素菌株的构建

1.5.2 大肠杆菌产β-胡萝卜素的构建

第二章核黄素操纵子的构建和比较

2.1 实验材料

2.1.1 菌株与质粒

2.1.2 实验仪器

2.1.3 实验试剂

2.1.4 培养基

2.1.5 溶液

2.2 实验方法

2.2.1 大肠杆菌CaCl_2转化法感受态细胞的制备与转化

2.2.2 大肠杆菌电转化感受态的制备和电转化

2.2.3 基因组DNA的提取

2.2.4 大肠杆菌质粒DNA的提取

2.2.5 DNA片段的PCR扩增

2.2.6 琼脂糖凝胶电泳

2.2.7 DNA片段的回收和纯化

2.2.8 DNA片段的酶切和连接

2.2.9 菌落PCR验证

2.2.10 菌体培养与发酵

2.2.11 发酵液菌体浓度和葡萄糖的测定

2.2.12 发酵液中核黄素的测定

2.2.13 蛋白浓度测定

2.2.14 细胞粗酶液的制备

2.2.15 GTP环水解酶Ⅱ酶活力测定

2.2.16 核黄素合成酶酶活力测定

2.3 实验结果与讨论

2.3.1 大肠杆菌自身核黄素合成途径的重构

2.3.2 枯草芽孢杆菌核黄素操纵子的克隆

2.3.3 枯草芽孢杆菌核黄素操纵子的重构

2.3.4 系列工程菌株核黄素产量表征

2.3.5 GTP环水解酶Ⅱ酶和核黄素合成酶活力测定

2.4 本章小结

第三章产核黄素大肠杆菌中心碳代谢途径的代谢工程改造

3.1 实验材料

3.1.1 菌种和质粒

3.1.2 实验仪器

3.1.3 实验试剂

3.1.4 培养基

3.1.5 溶液

3.2 实验方法

3.2.1 Circular polymerase extension cloning

3.2.2 6-磷酸葡萄糖脱氢酶酶活力测定

3.2.3 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶酶活力测定

3.2.4 Real-Time荧光定量PCR

3.2.5 发酵液中有机酸的检测

3.2.6 大肠杆菌基于λ-red和Ⅰ-SceⅠ的基因重组

3.3 实验结果与讨论

3.3.1 谷氨酸棒状杆菌突变型zwf~(243)和gnd~(361)基因的过表达质粒构建

3.3.2 氧化磷酸戊糖途径过表达质粒的构建

3.3.3 pgi基因敲除菌株的构建

3.3.4 ED途径敲除菌株的构建

3.3.5 acs基因过表达菌株的构建

3.3.6 氧化磷酸戊糖途径的改造对核黄素产量的影响

3.3.7 pgi基因和ED途径的敲除对核黄素产量的影响

3.3.8 acs基因的过表达对乙酸积累的影响

3.4 本章小结

第四章 ribF基因的改造及发酵条件的优化

4.1 实验材料

4.1.1 菌种和质粒

4.1.2 实验仪器

4.1.3 实验试剂

4.1.4 培养基

4.1.5 溶液

4.2 实验方法

4.2.1 核黄素激酶酶活力测定

4.3 实验结果与讨论

4.3.1 ribF基因的改造

4.3.2 置换ribF基因野生RBS片段的构建

4.3.3 ribF基因野生RBS的置换

4.3.4 ribF基因的改造对核黄素产量的影响

4.3.5 发酵条件的优化

4.4 本章小结

第五章基于MEP途径的产β-胡萝卜素大肠杆菌构建

5.1 实验材料

5.1.1 菌种和质粒

5.1.2 实验仪器

5.1.3 实验试剂

5.1.4 培养基

5.1.5 溶液

5.2 实验方法

5.2.1 β-胡萝卜素的检测方法

5.2.2 β-胡萝卜素的发酵实验

5.2.3 基于CRISPR/Cas9系统λ-red重组

5.2.4 Golded Gate组装方法

5.2.5 gRNA质粒的构建

5.3 实验结果与讨论

5.3.1 整合β-胡萝卜素合成基因到大肠杆菌EcKan染色体上

5.3.2 MEP途径调控元件的片段构建

5.3.3 考察MEP途径单基因调控对β-胡萝卜素合成的影响

5.3.4 MEP途径的组合优化

5.4 本章小结

第六章中心碳代谢及MEP途径的组合优化对β-胡萝卜素产量的影响

6.1 实验材料

6.1.1 菌种和质粒

6.1.2 实验仪器

6.1.3 实验试剂

6.1.4 培养基

6.1.5 溶液

6.2 实验方法

6.2.1 高密度发酵重组大肠杆菌ZF237T

6.3 实验结果与讨论

6.3.1 中心碳代谢途径操作片段的构建

6.3.2 考察中心碳代谢单基因调控对β-胡萝卜素合成的影响

6.3.3 中心碳代谢组合操作对β-胡萝卜素合成的影响

6.3.4 β-胡萝卜素合成途径及MEP途径的组合操作

6.3.5 中心碳代谢及MEP途径的组合优化

6.3.6 高密度发酵产β-胡萝卜素重组大肠杆菌ZF237T

6.4 本章小结

第七章结论与展望

7.1 结论及创新点

7.1.1 主要结论

7.1.2 创新点

7.2 展望

参考文献

发表论文及参加科研情况说明

附录

致谢

【参考文献】