综合应用核磁共振和顺磁共振的大肠杆菌跨膜蛋白硫氰酸酶YgaP结构研究

发布时间：2017-03-21 15:17

  本文关键词：综合应用核磁共振和顺磁共振的大肠杆菌跨膜蛋白硫氰酸酶YgaP结构研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本论文中,我们通过应用液体核磁共振和位点特异性自旋标记的电子顺磁共振技术研究了大肠杆菌蛋白YgaP的结构和动力学特征。论文共分为四个部分。 第一章简要介绍了硫氰酸酶超家族蛋白。首先阐述了硫氰酸酶超家族的催化机制,并按照其结构的特点分为了四类,还对硫氰酸酶超家族所行使的解毒,生物大分子的合成,调控细胞周期等功能做了具体的描述。 第二章介绍了电子顺磁共振的基本理论及其在生物学方面的应用。简要描述了常用的自旋标记物和位点特异性自旋标记技术。通过在蛋白中引入自旋标记物,利用电子顺磁共振技术,可以得到蛋白具体位点的动力学和结构方面的信息。数据的分析主要集中在动力学参数,易趋性和距离信息这三个方面,并且通过实例印证了顺磁电子共振在研究蛋白结构及构象变化上的独特优势。还简要说明了电子顺磁共振在生物自由基和细胞膜中的应用。 第三章介绍了大肠杆菌蛋白YgaP的溶液结构研究。我们通过核磁共振技术解析了YgaP硫氰酸酶结构域的三维结构,并与大肠杆菌中其他硫氰酸酶蛋白G1pE和PspE作比较,发现它们在结构上的相似性。随后通过Na2S2O3滴定的方法,研究了YgaP与底物之间的相互作用。通过化学位移的扰动,确定了其活性位点loop形成的底物结合口袋,以及在酶促反应的第一步时底物与酶的结合过程在NMR时间尺度上为快交换过程。并且由Ala66和Asn72的化学位移的变化得到了解离常数Kd的值。 第四章首先简要描述了利用电子顺磁共振解析膜蛋白结构信息。在实验中通过半胱氨酸扫描法,逐点标记YgaP跨膜区的45个氨基酸位点,利用电子顺磁共振技术研究其易趋性和动力学性质。通过数据分析,得知在DPC胶束中,YgaP以同源二聚体的形式存在。根据标记位点的动力学和易趋性以3.6为一个周期的波动的特点,发现了其跨膜区二级结构为两跨膜的α螺旋。确定了YgaP跨膜区的起始和结束位置及跨膜螺旋的相互作用的接触面,并结合测量所得的距离信息,搭建出了YgaP跨膜区的结构模型。并且结合YgaP硫氰酸酶结构域的溶液NMR结构,利用CW-EPR和DEER所得的距离约束得到了全长的YgaP的结构模型。
【关键词】：硫氰酸酶 核磁共振 电子顺磁共振 位点特异性自旋标记 易趋性滴定 快交换 结构模型
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q936
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 目录8-12
• 第一章 硫氰酸酶的结构和功能简介12-24
• 1.1 前言12-13
• 1.2 硫氰酸酶的催化机制13-14
• 1.3 硫氰酸酶同源结构域14-15
• 1.4 硫氰酸酶的分类15-17
• 1.4.1 串联结构域蛋白15
• 1.4.2 单一结构域蛋白15-16
• 1.4.3 复合结构域蛋白16-17
• 1.4.4 长活性位点蛋白17
• 1.5 硫氰酸酶的生物学功能17-22
• 1.5.1 氰化物解毒作用18-19
• 1.5.2 硫胺和硫脲苷的合成19-20
• 1.5.3 钼蛋白辅助因子的合成20-21
• 1.5.4 含硒生物大分子的合成21
• 1.5.5 调控细胞周期21-22
• 1.5.6 硫氰酸酶的其他功能22
• 1.6 硫氰酸酶超家族研究的展望22-24
• 第二章 电子顺磁共振基本理论及在蛋白质研究中的应用24-44
• 2.1 前言24
• 2.2 电子顺磁共振基本原理及谱仪简介24-27
• 2.2.1 电子顺磁共振基本原理24-25
• 2.2.2 电子顺磁共振谱仪25-26
• 2.2.3 信号收集时仪器参数26-27
• 2.3 自旋标记技术27-29
• 2.3.1 自旋标记物27-28
• 2.3.2 位点特异性自旋标记(SDSL)28-29
• 2.4 从SDSL-EPR得到的主要信息29-35
• 2.4.1 动力学信息(motion)30-32
• 2.4.2 溶剂易趋性(Accessibilty)32-33
• 2.4.3 距离信息33-35
• 2.5 SDSL-EPR在蛋白质研究中的应用35-41
• 2.5.1 通过动力学和易趋性信息确定蛋白质二级结构35-37
• 2.5.2 蛋白的入膜深度37-38
• 2.5.3 检测蛋白质的构象变化38-41
• 2.6 在生物学其他方面的应用41-42
• 2.7 小结42-44
• 第三章 大肠杆菌YgaP的硫氰酸酶结构域的结构及功能研究44-72
• 3.1 前言44-46
• 3.2 实验材料与方法46-60
• 3.2.1 引物设计46-47
• 3.2.2 PCR反应47-48
• 3.2.3 PCR产物的鉴定和回收48
• 3.2.4 双酶切反应48-49
• 3.2.5 连接反应49-50
• 3.2.6 连接产物的转化50
• 3.2.7 菌落PCR和双酶切鉴定50-51
• 3.2.8 蛋白表达条件的筛选51-52
• 3.2.9 YgaP(1-107)的表达52
• 3.2.10 YgaP(1-107)蛋白纯化及核磁样品的制备52-53
• 3.2.11 核磁实验53
• 3.2.12 主链归属53-56
• 3.2.13 侧链原子的化学位移归属56-58
• 3.2.14 二级结构预测及二面角约58
• 3.2.15 距离约束信息58-59
• 3.2.16 Na_2S_2O_3和NaSCN滴定59-60
• 3.3 实验结果与讨论60-69
• 3.3.1 YgaP硫氰酸酶结构域的化学位移归属60-61
• 3.3.2 Talos+二级结构预测61-62
• 3.3.3 YgaP(1-107)的溶液结构62-66
• 3.3.4 硫氰酸酶结构域的结构比对66
• 3.3.5 Na_2S_2O_3和NaSCN滴定实验66-69
• 3.4 小结69-72
• 第四章 利用电子顺磁共振技术解析YgaP跨膜区拓扑模型72-96
• 4.1 引言72-73
• 4.2 实验材料和方法73-83
• 4.2.1 YgaP蛋白序列和二级结构预测73-74
• 4.2.2 位点突变74-75
• 4.2.3 YgaP的表达75
• 4.2.4 YgaP的融膜去污剂的筛选75-76
• 4.2.5 蛋白纯化及洗脱去污剂的筛选76
• 4.2.6 用分子筛纯化蛋白76-77
• 4.2.7 突变位点的MTSL标记77
• 4.2.8 圆二色谱实验77-78
• 4.2.9 连续波EPR实验78
• 4.2.10 功率饱和EPR实验78-79
• 4.2.11 DEER光谱收集79-80
• 4.2.12 CW-EPR及DEER的光谱处理及距离拟合80-82
• 4.2.13 距离数据处理82
• 4.2.14 YgaP刚性结构模型的搭建82-83
• 4.3 实验结果与讨论83-93
• 4.3.1 YgaP的表达纯化83-85
• 4.3.2 YgaP跨膜区的动力学特性85-87
• 4.3.3 YgaP跨膜区的易趋性特征87-89
• 4.3.4 YgaP跨膜区的距离信息及结构模型建立89-93
• 4.4 小结93-96
• 参考文献96-106
• 附录106-110
• 致谢110-111
• 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果111

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 王硕;于佳一;李惟;李菲;;SDS胶束溶液中Exendin-4活性类似物结构分析[J];高等学校化学学报;2011年04期

2 洪晶;郭晨云;刘华;梁爱华;林东海;汪少芸;;八肋游仆虫中心蛋白的核磁共振研究[J];福州大学学报(自然科学版);2012年06期

3 黄飞娟;杜为红;王保怀;;含有D型氨基酸的新型毒肽——芋螺马芬在pH5的溶液结构(英文)[J];物理化学学报;2008年09期

4 赵兴旺;刘冉冉;郑麦青;文杰;陈继兰;赵桂苹;;鸡MyD88-TIR的同源模建[J];生物信息学;2011年04期

5 段绍瑾;;Application of Theories of Free Radicals and Electron Spin Resonance for Research of Traditional Chinese Medicine[J];Journal of Traditional Chinese Medicine;2000年01期

6 刘忠超;张文艺;王亮;张海英;崔松野;阮书洲;焦玲;;血清白蛋白电子自旋共振波谱在肿瘤诊断中的应用[J];中国实验诊断学;2013年10期

7 朱超;解井坤;花莉;杨冰;沈烁;;产自Bacillus sp.的热稳定偶氮还原酶结构模型研究[J];陕西科技大学学报(自然科学版);2014年06期

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 刘长东;Cdt1结合结构域与Mcm6结合结构域的NMR结构研究[D];华东师范大学;2011年

2 姚文明;用多维核磁共振技术研究人去甲基化酶JARID1B-ARID的溶液结构及其与DNA的相互作用[D];华东师范大学;2011年

3 纪鹏;人类ZO-1蛋白第二个PDZ结构域的溶液结构与功能[D];中国科学技术大学;2010年

4 吴芳明;酿酒酵母蛋白Prp20p以及人源锌指蛋白DESR1的结构与功能研究[D];中国科学技术大学;2010年

5 王硕;两种多肽类药物结构的谱学研究[D];吉林大学;2011年

6 彭恒;多期联合疟疾疫苗抗原结构与免疫保护作用的研究[D];第二军医大学;2011年

7 姚向阳;牛蒡子苷元抗肿瘤的分子机制研究[D];南京师范大学;2011年

8 王珏;PAK家族蛋白的自激活调控机制[D];清华大学;2010年

9 徐国华;抗菌肽HEDISTIN和二氢叶酸还原酶突变体DHFR-W21H的结构及生物作用机制研究[D];华中师范大学;2011年

10 范楷;肺炎链球菌HtrA蛋白PDZ结构域和嗜盐古菌SAMPs蛋白结构与功能研究[D];中国科学技术大学;2011年

  本文关键词：综合应用核磁共振和顺磁共振的大肠杆菌跨膜蛋白硫氰酸酶YgaP结构研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：259879