玉米逆境胁迫诱导型启动子PZmCKS2、PZmCBF3及转录因子ZmZBED的功能解析

发布时间：2017-04-11 06:16

  本文关键词：玉米逆境胁迫诱导型启动子PZmCKS2、PZmCBF3及转录因子ZmZBED的功能解析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：逆境胁迫是目前农业生产中影响粮食产量最重要的因素和挑战之一。通过转基因技术提高作物抗逆性是有效应对逆境挑战的根本途径，而克隆和组建逆境诱导型启动子是进行多抗基因转化从而实现分子育种目标的重要保障。目前，从实践上应用的启动子来看，仍以CaMV35S、玉米Ubiquitin promoter等组成型表达启动子为主，无法实现高效、可控和特异（定点、定时、定量）的调控，，而且由35S启动的基因过表达会使转基因植物生长发育产生一些负面效应，如矮化等。而诱导表达型启动子能指导外源基因在植物发育过程中某一特定时间和空间里进行表达，并使目的基因的表达产物在一定时间进行积累，避免了植物营养的浪费，也降低了对植物的不良影响。因此克隆并应用诱导型启动子来启动抗逆基因的表达，在提高植物的抗性方面具有重要意义。 本课题组应用基因芯片技术对玉米幼苗在低温和干旱条件下的表达谱进行了分析，获得了逆境胁迫诱导下基因的表达信息。以此为基础，本研究筛选了玉米中受低温、干旱诱导显著表达的蛋白激酶基因（ZmCKS2）和转录因子（ZmCBF3）基因为研究对象，与玉米B73全基因组序列比对、查询了表达基因上游DNA序列。利用特异性引物对ZmCKS2和ZmCBF3启动子进行了克隆，构建了5′-端缺失表达载体，并对其介导的GUS基因在转基因拟南芥中的表达进行了分析；同时利用酵母单杂交技术分离到一个可以和ZmCKS2启动子结合的转录因子，并对其进行了初步的功能分析，主要结果如下： 1.通过实时定量PCR结果分析，发现ZmCKS2基因表达受低温、干旱和ABA的诱导。为此，根据ZmCKS2基因编码区的上游序列，设计特异性引物，从玉米基因组中克隆到长度为1853bp的ZmCKS2启动子。对启动子序列在线预测分析发现该序列中含有多种顺式作用元件，如MBS、CE3、TGA-element和ABRE等。 2.将ZmCKS2启动子定向替换植物双元表达载体pCAMBIA1301中35S启动子，将其与GUS报告基因融合，通过农杆菌介导的方法转化拟南芥。结果发现ZmCKS2启动子受非生物胁迫（干旱、低温）和不同激素（ABA、 MeJA、SA）的多因素诱导。 3.构建ZmCKS2启动子5′-端一系列缺失表达载体，通过农杆菌介导的方法转化拟南芥。结果显示，缺失启动子P1(999)具有最高的基本表达活性，缺失启动子P2(367)是受低温、MeJA和SA诱导的最小的启动子片段。一些顺式作用元件对ZmCKS2启动子受胁迫和激素的诱导起重要作用。通过ABREs功能分析发现，ABRE和CE3元件是ZmCKS2基因的正调控元件，二者需要同时存在才能响应ABA信号并发挥作用；ABRE和CE3元件的作用效果与二者的数量不成正比例。 4.通过对ZmCBF3基因启动子5′-端一系列缺失表达载体转化拟南芥功能分析，结果表明ZmCBF3起始密码子上游234bp的启动子序列在各缺失具启动子中活性最强。ZmCBF3启动子活性受低温的诱导，MYCCONSENSUSAT elements(CANNTG)对此启动子在低温下的表达起到正调控作用。同时发现，ZmCBF3启动子在根中具有较强的组织特异性表达活性，这与根特异性表达元件RAV1AAT和ROOTMOTIFPOX1有关。 5.利用酵母单杂交技术分离到一个可以和ZmCKS2启动子结合的转录因子，该基因编码区编码174个氨基酸，包含一个由65个氨基酸组成的BED锌指结合域，起于第78个氨基酸终于第142个氨基酸。同源序列比较发现，该基因与其它生物物种的同源性比较低，与烟草、番茄和拟南芥的同源性分别为14.47%，8.48%和4.66%。该基因命名为ZmZBED。经在线软件预测分析发现，该基因编码蛋白没有信号肽，定位于细胞核中。 6.通过烟草瞬时表达活性分析，研究了ZmZBED与ZmCKS2启动子的互作。结果表明，ZmZBED是ZmCKS2启动子的正调控因子，可以调控ZmCKS2基因的表达。
【关键词】：玉米 启动子 逆境诱导 酵母单杂交 转录因子 功能分析
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-13
• 英文缩写词表13-15
• 第1章 绪论15-35
• 1.1 植物启动子的结构和功能研究15-27
• 1.1.1 真核生物启动子结构15-18
• 1.1.2 启动子类型18-24
• 1.1.2.1 组成型启动子20-21
• 1.1.2.2 组织特异性启动子21-23
• 1.1.2.3 诱导型启动子23-24
• 1.1.3 启动子克隆方法24-25
• 1.1.4 启动子序列分析25-26
• 1.1.5 启动子活性测定的方法步骤26-27
• 1.1.5.1 组织化学染色法26-27
• 1.1.5.2 Southern 杂交、 Western 杂交、酶联免疫法27
• 1.2 锌指型转录因子在植物抗逆中的研究27-33
• 1.2.1 植物 C2H2型锌指蛋白的结构分析28-31
• 1.2.1.1 DNA 结合域28-30
• 1.2.1.2 转录调控结构域30-31
• 1.2.2 C2H2型锌指蛋白参与生物和非生物逆境响应31-32
• 1.2.3 转基因植物过表达 C2H2型转录因子后的抗逆性32-33
• 1.2.4 C2H2型转录因子在植物胁迫应答网络中的作用33
• 1.3 本研究的目的意义33-35
• 第2章 ZmCKS2 启动子的克隆及功能分析35-77
• 2.1 材料35-41
• 2.1.1 植物材料、菌株及载体35-36
• 2.1.2 主要试剂36
• 2.1.3 主要设备36-37
• 2.1.4 试剂配制37-41
• 2.2 实验方法41-59
• 2.2.1 ZmCKS2 基因启动子（PZmCKS2）的克隆41-45
• 2.2.1.1 CTAB 法提取植物 DNA41
• 2.2.1.2 引物设计41-42
• 2.2.1.3 PCR 扩增目的片段42
• 2.2.1.4 DNA 片段的纯化与回收42
• 2.2.1.5 目的片段与 T 载体的连接42-43
• 2.2.1.6 热击感受态 DH5α细胞的制备43-44
• 2.2.1.7 重组质粒向大肠杆菌中的转化44
• 2.2.1.8 重组质粒单菌落的快速鉴定44
• 2.2.1.9 重组质粒的提取和酶切鉴定44-45
• 2.2.1.10 序列测定45
• 2.2.2 启动子的生物信息学分析45
• 2.2.3 植物双元表达载体的构建45-47
• 2.2.3.1 植物双元表达载体的构建方法45-46
• 2.2.3.2 重组质粒 PZmCKS2:pMD18-T 和载体 pCAMBIA1301 酶切46
• 2.2.3.3 目的片段与表达载体的连接46
• 2.2.3.4 农杆菌感受态 EHA105 的制备和转化46-47
• 2.2.4 农杆菌介导的 GUS 基因在玉米种子中的瞬时表达47-48
• 2.2.4.1 玉米种子的提前处理47
• 2.2.4.2 农杆菌侵染发芽的玉米种子47-48
• 2.2.4.3 GUS 组织的化学染色48
• 2.2.5 材料的逆境胁迫处理48
• 2.2.6 植物 RNA 的提取48-49
• 2.2.7 单链 cDNA 的合成49
• 2.2.8 实时定量（Real-time） PCR49-50
• 2.2.9 5′-端缺失启动子的构建50
• 2.2.10 拟南芥侵染50-51
• 2.2.11 转基因拟南芥植株的筛选鉴定51
• 2.2.12 GUS 组织染色和定量分析51-52
• 2.2.12.1 GUS 组织染色的方法51
• 2.2.12.2 GUS 定量分析51-52
• 2.2.13 植物核蛋白的提取52-53
• 2.2.14 凝胶阻滞（EMSA）53-57
• 2.2.15 ABA 应答作用元件表达载体的构建57-58
• 2.2.16 农杆菌介导的烟草叶片转化及逆境处理58-59
• 2.3 实验结果与分析59-73
• 2.3.1 ZmCKS2 启动子（PZmCKS2）的克隆和序列分析59-62
• 2.3.2 ZmCKS2 在非生物胁迫下的表达62-63
• 2.3.3 ZmCKS2 启动子植物双元表达载体的构建63
• 2.3.4 ZmCKS2 启动子活性的初步鉴定63-64
• 2.3.5 5′-端缺失启动子的构建64-65
• 2.3.6 转基因拟南芥的筛选与 PCR 鉴定65-66
• 2.3.7 不同启动子片段在拟南芥中的基本表达活性分析66-67
• 2.3.8 不同启动子片段在逆境条件下的表达活性分析67-69
• 2.3.9 不同启动子片段在激素诱导下的表达活性分析69
• 2.3.10 ABA 应答元件（ABREs）的功能分析69-73
• 2.3.10.1 ABA 应答元件与玉米核蛋白的结合69-71
• 2.3.10.2 ABA 应答元件植物表达载体的构建71-72
• 2.3.10.3 ABA 应答元件的功能分析72-73
• 2.4 讨论73-77
• 第3章 ZmCBF3 基因启动子的克隆和功能分析77-95
• 3.1 实验材料与试剂77-80
• 3.1.1 植物材料、菌株及载体77-78
• 3.1.2 主要试剂78
• 3.1.3 主要设备78
• 3.1.4 试剂配制78-80
• 3.2 实验方法80-83
• 3.2.1 ZmCBF3 基因启动子（PZmCBF3）的克隆80-83
• 3.2.1.1 CTAB 法提取植物 DNA80
• 3.2.1.2 引物设计80-81
• 3.2.1.3 PCR 扩增目的片段81
• 3.2.1.4 重组质粒 PZmCBF3:pMD18-T 和载体 pCAMBIA1301 酶切81-82
• 3.2.1.5 目的片段与表达载体的连接82
• 3.2.1.6 5′-端缺失启动子的构建82-83
• 3.3 结果与分析83-92
• 3.3.1 ZmCBF3 启动子（PZmCBF3）的克隆和序列分析83-86
• 3.3.2 ZmCBF3 启动子植物双元表达载体的构建86-87
• 3.3.3 5′-端缺失启动子的构建87-88
• 3.3.4 转基因拟南芥的筛选与 PCR 鉴定88-89
• 3.3.5 不同启动子片段在拟南芥中的基本表达活性分析89
• 3.3.6 不同启动子片段在逆境条件下的表达活性分析89-92
• 3.3.7 组织特异性表达分析92
• 3.4 讨论92-95
• 第4章 转录因子 ZmZBED 基因的克隆与功能分析95-113
• 4.1 材料95-96
• 4.1.1 植物材料、菌株及载体95
• 4.1.2 主要试剂95-96
• 4.1.3 主要设备96
• 4.1.4 主要试剂的配制96
• 4.2 实验方法96-101
• 4.2.1 酵母感受态的制备及转化96-97
• 4.2.2 PCR 鉴定酵母转化子克隆97
• 4.2.3 酵母质粒的提取97-98
• 4.2.4 酵母单杂交 cDNA 文库的构建和质量检测98-99
• 4.2.4.1 库容量的鉴定98
• 4.2.4.2 重组率和插入片段长度鉴定98-99
• 4.2.5 诱饵质粒和文库质粒的共转化99-100
• 4.2.6 阳性酵母克隆的筛选100
• 4.2.7 ZmZBED 基因特性在线分析100
• 4.2.8 ZmZBED 植物表达载体的构建100-101
• 4.2.9 ZmZBED 对 PZmCKS2 启动子在烟草中瞬时表达活性的影响分析101
• 4.3 结果与分析101-111
• 4.3.1 酵母单杂诱饵载体的构建101-102
• 4.3.2 酵母单杂 cDNA 文库的质量鉴定102
• 4.3.2.1 酵母 cDNA 文库总克隆数 CFU 的鉴定102
• 4.3.2.2 文库插入片段长度鉴定102
• 4.3.3 诱饵载体和 cDNA 文库质粒的酵母转化与筛选102-104
• 4.3.4 阳性克隆的复筛104
• 4.3.5 阳性克隆的序列分析104-106
• 4.3.6 ZmZBED 基因的生物信息学分析106-108
• 4.3.6.1 ZmZBED 氨基酸序列特征分析106-107
• 4.3.6.2 ZmZBED 亚细胞定位预测107-108
• 4.3.6.3 ZmZBED 的信号肽分析108
• 4.3.7 ZmZBED 同源性比对与进化树分析108-110
• 4.3.8 ZmZBED 对 PZmCKS2 启动子在烟草中瞬时表达活性的影响分析110-111
• 4.4 讨论111-113
• 结论113-115
• 论文的创新、问题与展望115-117
• 参考文献117-129
• 附表：本实验所用引物汇总129-131
• 作者简介及科研成果131-133
• 致谢133

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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本文编号：298491