家蚕转绿色荧光蛋白—蜘蛛丝蛋白融合基因的研究

发布时间：2024-05-08 02:15

　　为了改善蚕丝的机械性,本研究以piggy Bac转座子载体为骨架,构建了含有家蚕丝素重链蛋白的N-端区域(NTD)-绿色荧光蛋白(e GFP)-蜘蛛丝蛋白[A2S8]28-重链蛋白的C-端区域(CTD)融合基因表达元件的打靶载体p XL-NTD-e GFP-Spider-CTD,同时根据丝素重链基因内含子区域((AF226688:63011-63025和63052-63066)的DNA序列,设计组装了TALENs序列,构建了靶向丝素重链基因内含子区域的TALEN 9-10载体;SURVEYOR和lac Z中断法证实TALEN 9-10载体在家蚕卵母细胞株(Bm N cells)中的效率约为13.95%。将TALEN 9-10载体与打靶载体p XL-NTD-e GFP-Spider-CTD混合,通过真空电穿孔技术,导入家蚕初产卵,筛选获得G0代转基因家蚕。PCR检测结果显示,G0代转基因家蚕蚕蛾基因组中有报告基因e GFP(enhance green fluorescence protein gene)的存在;Western Dot Blot检测转基因家蚕蚕茧蛋白样品,证实转基因家蚕表达...

【文章页数】：149 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一章 综述
    1 转基因家蚕的研究
        1.1 家蚕转基因载体系统的构建与发展
        1.2 外源基因导入家蚕方法
        1.3 利用家蚕生产蜘蛛丝蛋白
    2 基因组编辑技术的发展及现状
    参考文献
第二章 研究目的与研究内容
    1 研究目的与意义
    2 研究内容与技术路线
        2.1 主要研究内容
        2.2 研究技术路线
第三章 常用实验材料与方法
    1 常用仪器
    2. 常用的实验方法
        2.1 DNA的连接反应体系
        2.2 连接产物的转化
        2.3 小剂量抽取质粒DNA的方法(QIAGEN Mini-preps)
        2.4 质粒DNA的中量提取
        2.5 DNA的酶切反应体系
        2.6 家蚕基因组DNA提取
        2.7 目的片段的分离和回收
        2.8 PCR产物的纯化
        2.9 PCR扩增目的片段
        2.10 琼脂糖凝胶电泳
        2.11 细胞的培养和保存
        2.12 BmN细胞基因组的抽提方法
第四章TALENs质粒的构建及其效率在细胞中的检测
    摘要
    1 引言
    2. 材料与方法
        2.1 TALENs的设计
        2.2 TALENs的构建
        2.3 将构建好的pTAL3- TALEN(9-10) 载体改造为pIE-TALEN(9-10) 载体
        2.4 SURVEYOR核酸酶检测TALEN(9-10)在BmN细胞中的作用效率
        2.5 Lac Z中断法检测TALEN (9-10) 在BmN细胞中的切割特异性
    3 结果与分析
        3.1 pTAL3-TALEN(9-10)质粒的鉴定
        3.2 pIE-TALEN(9-10) 载体的构建
        3.3 SURVEYOR核酸酶检测pIE-TALEN (9-10)剪切效率
        3.4 lacZ中断法检测p IE-TALEN(9-10)切割特异性
    4 讨论
    参考文献
第五章 转蜘蛛丝蛋白基因的供体质粒pXL-NTD-eGFP-Spider-CTD的构建
    摘要
    1 引言
    2 材料与方法
        2.1 pXL-BACII-MCS的构建
        2.2 蚕丝重链C-段(CTD)的装配
        2.3 蜘蛛丝基因Spider[A2S8]28的装配
        2.4 重链蛋白的N-端部分(NTD)和eGFP的装配
    3 结果与分析
        3.1 pXL-BACII-MCS的鉴定
        3.2 pXL-BACII-CTD的鉴定
        3.3 Spider[A2S8]28的装配及pIEx1Spider的鉴定
        3.4 pXL-NTD-eGFP-Spider-CTD的鉴定
    参考文献
第六章 转基因家蚕的制作、筛选与鉴定
    摘要
    1 引言
    2 材料与方法
        2.1 真空电穿孔法将质粒导入初产卵
        2.2 电穿孔处理蚕卵的检测
        2.3 定性检测转基因蚕茧及蚕茧蛋白
        2.4 ELISA定量检测蛛丝蛋白的水平
        2.5 转基因家蚕的鉴定
        2.6 反向PCR检测外源基因在家蚕基因组中的定位
    3 结果与分析
        3.1 电穿孔处理家蚕蚕卵的荧光观察与PCR检测
        3.2 G0 代转基因蚕茧的荧光观察与表达产物检测
    4 讨论
    参考文献
第七章 转基因家蚕蚕丝机械性能的检测
    摘要
    1 引言
    2. 材料与方法
        2.1 蚕丝机械性能的测试具体方法
        2.2 数据分析
    3. 结果与分析
        3.1 转基因蚕丝的最大极限拉力和最大弹性应力
        3.2 转基因蚕丝A-D组机械性能指标对比
    4 讨论
    参考文献
第八章 G1 代转基因家蚕丝的机械性能研究
    摘要
    1 引言
    2 材料与方法
        2.1 转基因家蚕蚕茧的传代、分组及转基因蚕丝蛋白中eGFP含量的检测
        2.2 茧丝的机械性能的测定方法
    3 结果与分析
        3.1 G1 代转基因家蚕茧丝蛋白中eGFP含量的测定
        3.2 转基因茧丝的机械性能
    4 讨论
    参考文献
结论与创新点
资助项目
附录
    附件一TALENs (9-10)的相关DNA序列
    附录二pTAL3 载体DNA序列
    附件三pBR322-lac Z载体的DNA序列
    附件四TALENs (9-10)在靶定位点作用效率检测相关测序结果
    附件五pXL-BACⅡ-NTD-eGFP-Spider[A2S8]28-NTD载体序列
    附件六Piggybac染色体定位DNA序列测序结果
    附件七G1 中的转基因家蚕茧丝机械性能数据汇总
致谢



本文编号：3967341