锦鲤疱疹病毒减毒株的筛选及免疫原性的研究

发布时间：2016-11-16 22:18

  本文关键词：嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠道炎症机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

《吉林农业大学》 2015年

锦鲤疱疹病毒减毒株的筛选及免疫原性的研究

刘建平  

【摘要】：锦鲤疱疹病毒(KHV),也称为鲤科疱疹病毒3型(CyHV-3)或鲤鱼鳃坏死和间质性肾炎病毒(CNGV),是一种对鲤鱼和锦鲤具有高度传染性,高致命性的病原体。由该病毒感染引起的疾病称为锦鲤疱疹病毒病。受锦鲤疱疹病毒病(KHVD)影响的鱼塘死亡率有时会高达70-95%,该病在以色列大规模爆发并被首次报道,90年代初美国和欧洲等国陆续被该病困扰,近十多年来我国的鲤鱼养殖业也受到严重威胁,这种高致病性疾病已迅速蔓延至世界各地的水产养殖业,并造成了严重的经济损失。但是至今还未研制出针对该病的特效疫苗。本研究以减弱锦鲤疱疹病毒强毒株(KHV-CJ)的毒力为主线,用中草药细叶桉叶来辅助减弱病毒毒力,加快KHV-CJ的毒力致弱,最后将获得的减毒株对鲤鱼进行免疫试验以及攻毒试验,来研究其免疫保护效果。研究内容及结果如下:1.桉液对细胞及病毒在细胞内复制情况的影响。采用MTT法将不同浓度的桉液作用细胞,96h检测其对细胞的毒性,设置6组不同的桉液浓度10mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml的实验组和无药物作用的对照组,在酶标仪OD490nm处测量其吸光度,利用公式来计算其细胞存活率。在对细胞安全的浓度范围下,通过观察CPE和MTT来研究抑制KHV增殖复制的效果。结果表明:桉液浓度为0.2mg/ml和0.1mg/ml时,作用于KF-1细胞,细胞存活率明显高于其他稀释浓度,因此桉液浓度为0.2mg/ml为最高细胞安全生长浓度。在桉液浓度0.2mg/ml时,对KHV的增殖复制有明显的抑制作用。2.锦鲤疱疹病毒减毒株的筛选及免疫原性的研究。将KHV-CJ连续传至52代,根据Reed-Muench两氏法测定每代病毒的TCID50。把P3、P21、P52(TCID50效价为10-6.59;10-5.87;10-4.61),灭活病毒对照组和PBS对照组分别免疫接种于鲤鱼,每免疫组免疫剂量为100TCID50,免疫注射于腹腔,在3周后进行加强免疫。免疫后每隔7d进行采血。利用ELISA方法检测特异性抗体效价,中和实验来测定中和抗体水平,加强免疫后三周设置攻毒组和对照组来测定免疫保护情况,并利用病理组织切片来验证减毒株的保护力。结果显示:免疫注射P3组鲤鱼死亡率达90%,毒株未致弱。免疫注射P21组的死亡率也有25%以上,说明毒株未被完全致弱;灭活病毒组的死亡率较低,仅有10%,而免疫注射P52组的全部存活,说明P52组免疫保护力较高。ELISA的结果表明P52组诱导的KHV特异性抗体高于灭活病毒对照组,而对照组却未检测出OD450值的变化。中和试验的结果表明,对照组鲤鱼均没有产生中和抗体,与ELISA结果相似,P52组产生的中和抗体水平高于灭活病毒组。通过攻毒试验的结果可以看出免疫组的保护率高于灭活病毒组。对病理切片的观察,免疫组的组织未发生病理变化,灭活病毒组有部分组织发生病变,而对照组组织全部发生病理变化。说明本研究成功筛选出KHV的减毒株其对鲤鱼有良好的保护力。

【关键词】：
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S943
【目录】：

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