番茄黄化曲叶病毒编码的V2蛋白抑制转录水平基因沉默研究

发布时间：2016-11-19 03:32

  本文关键词：番茄黄化曲叶病毒编码的V2蛋白抑制转录水平基因沉默研究，由笔耕文化传播整理发布。

《浙江大学》 2015年

番茄黄化曲叶病毒编码的V2蛋白抑制转录水平基因沉默研究

王碧  

【摘要】：番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)是隶属于菜豆金色花叶病毒属的单组份双生病毒,能够在寄主植物上引起严重的叶片黄化、下卷及矮化等症状。自2006年先后在上海番茄上发现TYLCV后,TYLCV引起的番茄黄化曲叶病在我国发展凶猛并已呈扩展蔓延的趋势,造成了严重的经济损失。TYLCV编码的V2蛋白是一个RNA沉默抑制子,能抑制转录后基因沉默(Post-transcriptional gene silencing, PTGS),但对其是否抑制转录水平基因沉默(Transcriptional gene silencing, TGS)没有报道。为了进一步弄清TYLCV编码的V2蛋白在TYLCV侵染及致病中的作用,我们对V2蛋白抑制TGS进行了探究。 通过TYLCV侵染性克隆接种16-TGS植株,明确TYLCV病毒自身可以抑制TGS。随后,利用马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)异源病毒表达载体表达病毒蛋白并接种16-TGS植株,发现V2蛋白能够像TYLCV那样回复GFP转基因的TGS。亚硫酸氢盐测序和甲基化敏感性限制性内切酶PCR实验表明TYLCV或PVX-V2接种的16-TGS植株中35S启动子胞嘧啶甲基化受到抑制。在此基础上,利用转基因技术获得在拟南芥中稳定表达V2的拟南芥遗传材料,与野生型植株相比,转V2基因的拟南芥呈现开花延迟的表型,并且其内源表观沉默位点的甲基化受到干扰。 以TYLCV V2蛋白为诱饵,利用酵母双杂交(Yeast two hybrid, Y2H)系统从本氏烟cDNA文库中筛选与V2蛋白互作的寄主因子。将诱饵质粒pGBKT7-V2和本氏烟cDNA文库质粒共转化酵母Y2HGold,通过SD/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal营养缺陷型培养基筛选,最终确定了NbHDA6为TYLCV V2蛋白的寄主互作因子。同源序列比对发现NbHDA6基因全长为1,368bp,预测编码一个含456个氨基酸,分子量约51kD的蛋白；与茸毛烟、番茄、葡萄、川桑、可可及拟南芥编码的HDA6基因均具有很高的氨基酸同源性。TNbHDA6属于第一类与酵母RPD3蛋白同源的去乙酰化酶,在N端含有一个保守的组蛋白去乙酰化酶结构域；中间含有组蛋白去乙酰化酶必需的活性位点；C端则包含甘氨酸富集区和天冬氨酸富集区。通过双分子荧光互补实验(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC)证实V2和NbHDA6能够在烟草表皮细胞中互作,且互作发生在细胞核或细胞质中。将V2和NbHDA6分别进行体外原核表达和纯化,GST pull down实验进一步证实了两者在体外的直接互作。 利用半定量RT-PCR技术分析了NbHDA6mRNA在本氏烟不同组织中的表达特异性,NbHDA6mRNA在根中积累量最高,在花中次之,而在叶和茎中的积累量较低；通过融合GFP的植物瞬时表达载体在烟草表皮细胞中表达NbHDA6-GFP,明确了NbHDA6定位于细胞核中。此外,利用转基因技术在拟南芥HDA6突变体axe1-5中转入NbHDA6,发现其能够回补axe1-5突变体的迟花表型以及H3、H4的组蛋白高乙酰化水平,这些结果表明NbHDA6能够回这；社AtHDA6在拟南芥中的组蛋白去乙酰化生物学功能。 为了解V2与NbHDA6互作的生物学意义,以接种TYLCV或PVX-V2和空载体pBinPLUS或PVX的本氏烟叶片总RNA为模板,通过real time RT-PCR和半定量RT-PCR比较分析了各组植物中NbHDA6mRNA积累量的差异,结果证实不管是接种TYLCV或PVX-V2, NbHDA6mRNA的积累量都被显著下调。利用TRV载体沉默本氏烟中的NbHDA6基因,将野生型和NbHDA6沉默的植株一起进行病毒接种实验。结果表明,与野生型本氏烟相比,TYLCV的侵染效率在NbHDA6下调表达的植株中显著提高,Southern blot检测到的病毒积累量明显高于对照。亚硫酸氢盐测序和甲基化敏感性限制性内切酶PCR实验表明在NbHDA6下调表达的植株中TYLCV病毒的甲基化受到抑制。这些结果证实NbHDA6蛋白的积累影响了病毒的侵染,是寄主植物通过对病毒基因组的甲基化来抵御病毒的侵染所必需的。将V2和NbHDA6蛋白分别进行体外融合表达和纯化,随后检测V2对NbHDA6组蛋白去乙酰化酶的活性的影响。结果证实,NbHDA6自身具有较弱的组蛋白去乙酰化酶活性,且活性并不受V2的影响。随后,我们对NbMET1的第一个BAH (Bromo-adjacent homology,与HDA6互作的最小区域)结构域进行体外融合表达和纯化,利用GST pull down实验证实NbHDA6与NbMET1在体外的直接互作。最后,利用竞争性GST pull down实验发现,随着V2蛋白加入量的递增,被GST-NbHDA6拉下来的MBP-NbMET1蛋白的量随之递减,表明NbMET1和V2能够竞争结合NbHDA6。上述结果表明,TYLCV V2通过与HDA6互作减少HDA6与MET1的结合,进而丧失对病毒DNA的甲基化,从而突破植物对病毒的防御,提高病毒的侵染效率。

【关键词】：
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S432.41
【目录】：

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本文编号：181890