捻转血矛线虫感染诱导的宿主T淋巴细胞免疫应答研究

发布时间：2016-12-13 20:08

  本文关键词：捻转血矛线虫感染诱导的宿主T淋巴细胞免疫应答研究，由笔耕文化传播整理发布。

《浙江大学》 2015年

捻转血矛线虫感染诱导的宿主T淋巴细胞免疫应答研究

杨怡  

【摘要】：捻转血矛线虫能寄生于反刍动物皱胃引起严重的捻转血矛线虫病,偶尔也见于人和鼠等非适宜宿主。该病的发生呈现出气候、地理、牧场条件和宿主生理状态依赖性。耐药性的产生和有效疫苗的缺乏给防治工作带来困难,因此发展免疫学防治方法十分迫切。探明宿主针对捻转血矛线虫的免疫应答规律是发展免疫防治的重要研究方向。本研究对中国部分地区羊胃肠道寄生虫的流行病学和捻转血矛线虫的系统进化关系进行调查分析；建立绵羊的捻转血矛线虫人工单次感染模型,利用基因芯片技术分析感染前后T淋巴细胞基因表达谱的差异,进而通过qRT-PCR技术分析细胞因子表达的动态变化,明确T淋巴细胞的免疫应答规律；建立线虫-细胞共培养系统和沙鼠感染模型,观察线虫的生长发育并检测细胞和沙鼠的免疫指标变化,探明宿主的早期免疫反应。研究结果将为阐明宿主针对捻转血矛线虫的免疫应答规律奠定基础。1.中国部分地区羊胃肠道寄生虫病的流行病学调查和捻转血矛线虫系统进化分析本研究于2014年9-12月采集了来自山东、吉林、黑龙江、内蒙古、辽宁、河北、江苏、天津和青海9个省(市)的490份羊粪样品,进行了寄生虫虫卵的鉴定；于2004-2013年采集了来自浙江省嘉兴地区的15份捻转血矛线虫成虫样品,通过扩增ITS-2和ND4序列进行系统进化分析。结果表明,全国各地羊胃肠道寄生虫的感染情况均较严重,感染虫种严重程度依次为原虫(83.27%)、线虫(64.29%)和绦虫(49.80%),感染较严重的三个地区为天津、青海和内蒙古,感染较轻的三个地区为江苏、黑龙江、山东。对捻转血矛线虫嘉兴分离株的15个样品进行系统进化分析显示,ITS-2和ND4基因在10年间均有不同程度的遗传变异,变异范围分别为0.0%-3.9%和0.4%-4.8%,变异程度较小且呈随机性变化不随年份增加规律发生。本调查结果将为制定更合理的寄生虫防控方案提供参考依据。2.捻转血矛线虫感染诱导宿主T淋巴细胞差异基因表达谱的分析为研究宿主T淋巴细胞应对捻转血矛线虫感染的免疫应答,本试验将人工培养的捻转血矛线虫感染性三期幼虫(L3)单次攻入绵羊体内建立了感染模型。捻转血矛线虫感染绵羊后25d开始产卵,30d时达到顶峰,最高日产卵量为2,475卵/克粪,产卵时间持续18 d,证明寄生成功。感染30 d和60 d时T淋巴细胞增殖反应都显著增强,表明绵羊感染后细胞免疫反应被激发。血清中总IgG含量随感染日龄增加而上升,在30 d时达到顶峰,之后缓慢下降,直至稳定寄生时仍处于高含量,证明感染也诱发了绵羊的体液免疫反应。检测结果证实感染模型建立成功。在此基础上,分离了感染后0 d、3d、30d和60d的绵羊T淋巴细胞,通过基因芯片技术,比较了感染后各日龄之间T淋巴细胞的差异表达基因,分别在3d vs. 0d、30d vs. 0d、60d vs. 0d、30d vs. 3d、60d vs.3d和60d vs.30d比较组中获得了853、242、42、1058、805和102个差异表达基因。GO分析结果显示差异表达基因功能聚类主要为细胞组分、代谢过程、生物过程调节等,KEGG分析结果显示差异表达基因主要参与信号转导、细胞交流、细胞生长与衰亡、免疫系统过程等途径。对SLC9A3R2、ABCB9、COMMD4、SUGT1、FCER1G、 GSK3A, PAK4和FCER2等20个特异性表达的重要基因分析显示,它们的功能主要与细胞内稳态维持和免疫反应有关。抗蠕虫感染的重要因子IL-13在感染后60 d表达量上升,推测可能与感染后期绵羊彻底清除捻转血矛线虫有关。研究在一定程度上阐明了捻转血矛线虫感染宿主T淋巴细胞的免疫应答规律。3.绵羊T淋巴细胞应对捻转血矛线虫感染的免疫应答研究基于绵羊感染模型,本试验运用qRT-PCR技术检测了T淋巴细胞中13个经典细胞因子的表达量动态变化,结果显示感染3d时,调节型细胞因子IL-10和TGF-β表达升高,预示着绵羊早期感染时调节性免疫应答占主导地位。感染30 d时,Thl型细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-β、GM-CSF和Th2型细胞因子IL-13、IL-15、IL-33的表达量上调,提示机体内免疫环境逐渐由调节型转变为Thl型和Th2型。感染60 d时,Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-β、GM-CSF表达量上调而其他类型细胞因子表达量下降或无表达差异,表明Thl型免疫应答发挥主要作用。本试验进一步说明了T淋巴细胞参与抗捻转血矛线虫感染的免疫应答。4.线虫-细胞共培养模型的建立与体外早期免疫应答研究为研究宿主的早期免疫应答,本研究使用细胞小室建立了捻转血矛线虫-胃癌细胞气液界面共培养系统,观察到线虫在共培养系统中以弦运动和圆运动的方式生活；通过细胞远红外荧光染色技术发现线虫以细胞蛋白为食维持基本营养,进食的方式可能为叮咬胃癌细胞后吸食；脱鞘幼虫在体外培养系统中生长发育速度缓慢,共培养0d、4d和7d的虫体长度分别为981.5±24.3μm、1113.9±24.4μm和1157.0±47.6μm,其中7d时与宿主感染4d体内的虫体大小相似。结果表明共培养系统较为可靠。随着共培养时间的增加,捻转血矛线虫和细胞在共培养系统中互相胁迫,线虫呈现活力下降和蜷缩状的生理状态,同时贴壁细胞逐渐从胶原板脱落并进入坏死状态。相较于共培养0d时,共培养4d时MGC坏死的比例由12.91%增加到53.25%,BGC坏死的比例由2.63%增加到24.81%。线虫还能诱发细胞表达大量的IL-33,MGC与线虫共培养4d和7d时IL-33的表达量分别上升至共培养0d时的2.520倍和4.180倍,BGC与线虫共培养4d和7d时IL-33的表达量分别上升至共培养Od时的1.732倍和5.150倍,这与宿主早期感染时IL-33的高表达一致。本试验通过体外试验分析了早期感染对宿主造成的损伤和诱发的免疫应答。5.沙鼠感染捻转血矛线虫模型的初探为建立方便有效的捻转血矛线虫感染实验动物模型用以研究宿主的早期免疫应答,本试验使用沙鼠感染捻转血矛线虫。结果显示,沙鼠胃组织中获得的捻转血矛线虫处于四期早期,感染4d、7d和18d的虫体长度分别为1099.8±169.0μm、1273.0±121.7μm和1553.4±132.8μm。感染4d的幼虫已出现性别分化,感染7d的雌虫生殖原基分化出雌驱器原基,生长发育明显但较同时期羊体内滞后。线虫肠道细胞中存在棒状结晶体,代谢速度缓慢。感染前后沙鼠的血常规检测结果没有明显变化,胃组织切片未见明显的炎症反应。实验结果提示,捻转血矛线虫能在沙鼠胃内发育但与羊体内生长速度相比明显缓慢,是否能模拟羊早期感染的状态还待进一步实验证实。综上所述,本研究调查了中国部分地区羊胃肠道寄生虫病的流行病学和捻转血矛线虫的系统进化关系；分析了绵羊T淋巴细胞应对捻转血矛线虫感染的差异基因表达谱和免疫应答方式,一定程度上阐明了宿主的分子免疫应答规律；利用线虫-细胞体外共培养系统和沙鼠感染模型研究了宿主的早期免疫反应。本研究将为探明宿主针对捻转血矛线虫感染的免疫应答机制奠定良好基础,为制定有效的免疫防治策略提供重要参考。

【关键词】：
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S855.9
【目录】：

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