朊病毒种属屏障的分子机理研究与重组朊病毒食源性传播致病模型的建立
发布时间：2021-12-23 07:13
朊病毒疾病又称传染性海绵状脑病,是一种人畜共患的致死性神经退行性疾病,具有传染性、散发性或遗传性等特点。与传统病毒不同的是,朊病毒疾病的病原体是由宿主体内正常表达的朊蛋白（Pr PC）经过错误折叠后形成的;这种异常变构的朊蛋白(Pr PSc)一旦进入新的宿主,就可以把宿主Pr PC作为底物,诱导其构象转变成Pr PSc,从而导致Pr PSc的扩增,形成自我增殖和疾病的传染。通常将这类具有传染性的Pr PSc称为朊病毒。朊病毒与传统意义上的病毒概念不同,它的遗传物质主要是错构的蛋白质,在体外运用蛋白质错误构象循环扩增技术（s PMCA）就能将朊病毒扩增。在这一过程中,少量的Pr PSc作为种子加入至正常动物的脑匀浆或重组的朊蛋白（Pr P）中共同孵育,Pr PSc种子就可诱导Pr PC转变为Pr PSc,新生成的Pr PSc形成聚合物,在超声的作用下...
【文章来源】：华东师范大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：138 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
PrP一级结构与立体构象示意图(A)PrP一级结构示意图
华东师范大学博士学位论文3变为PrPSc，而新生成的PrPSc聚合物在超声的作用下能够形成更小的寡聚体核心，为后续的构象转变过程提供新的seed，如此超声—孵育的循环过程就能够在较短周期内将PrPSc在样本中进行扩增[8]。不仅如此，Soto等人还证明了通过sPMCA扩增得到的PrPSc能够保留与seed一致的特性，如动物感染后的潜伏期、不同脑区海绵状损伤得分、PK酶抗性、Westernblotting检测特征条带等[9]。图2.sPMCA工作原理和模型图在sPMCA过程中，将少量的含有PrPSc的脑匀浆作为种子加入至未被感染的脑匀浆中共同孵育，诱导其中的PrPC转变为PrPSc，新生成的PrPSc聚合物在超声的作用下形成更小的寡聚体核心，为后续的构象转变过程提供新的seed。Fig.2TheprocessofsPMCAIntheprocessofsPMCA,asmallamountofbrainhomogenatecontainingPrPScisaddedasseedintotheuninfectedbrainhomogenateforco-incubation,whichcaninducePrPCconversionintoPrPSc.ThenewlyformedPrPScaggregatesformasmalleroligomercorebysonication,providingnewseedsforthesubsequentconformationtransitionprocess.由于具有传染性，朊病毒疾病可以在许多种属中发生。通常情况下，朊病毒在本种属中能够有效传播，被感染的动物能够在数周或数月内发病并短时间内全部死亡；但跨种属传播的效率则变得非常低，动物生存时间存在很大的个体差异，或者完全不能跨种属传播。这其中小鼠和仓鼠朊病毒的种属屏障现象是最为典型的例子之一。因此，sPMCA在研究朊病毒种属屏障中的优势就得到了充分体现，一方面能够忠实保留某一物种朊病毒的特性，另一方面又能够大幅缩短研究时间。Soto团队利用sPMCA，以小鼠和仓鼠脑匀浆为实验材料，实现了小鼠/仓鼠朊病毒的跨种属传播，并且分离得到了全新的
华东师范大学博士学位论文4正是由于sPMCA技术能够在体外将朊病毒变构过程量化进行，为了彻底证明朊病毒的遗传信息储存于自身构象中，利用大肠杆菌表达重组PrP并诱导其转变为具有致病性的构象成了关键一步。我们实验室于2010年突破性地在sPMCA体系中引入了脂类分子和RNA作为辅助因子（cofactor），成功地将细菌表达的重组小鼠PrP转变成为具有PK酶抗性的构象（PrP-res），同时还具有高度传染性，能够使野生型小鼠在短期内获得朊病毒疾病[11]。这是世界上第一个在体外从无至有（denovo）合成的重组小鼠朊病毒，通过颅内注射的方式，野生型小鼠的平均生存时间约为180天[11,12]；通过腹腔注射的方式，同样使小鼠获得了朊病毒疾病，其生存时间约为210天[13]。图3.以重组小鼠PrPC为底物从无至有地制备重组小鼠PrPSc在sPMCA体系中引入了脂类分子和RNA作为辅助因子，将重组小鼠PrPC转变为具有致病性的重组小鼠PrPSc。Fig.3DenovogenerationofPrPScusingrecombinantmousePrPCassubstrateInthepresenceoflipidandRNAascofactors,wegeneratedaprionusingrecombinantmouseprionprotein.可以看到sPMCA技术是现代研究朊病毒疾病中的一种重要手段。在本文中，我们将探究一些朊病毒研究领域尚未解决的问题：一方面，以重组PrP为对象，利用sPMCA重点探究不相同的氨基酸位点对小鼠/仓鼠朊病毒种属屏障的影响，并尝试获得能够跨种属屏障的过渡型朊病毒，进而制备重组仓鼠朊病毒；另一方面，我们将
本文编号：3548037
【文章来源】：华东师范大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：138 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
PrP一级结构与立体构象示意图(A)PrP一级结构示意图
华东师范大学博士学位论文3变为PrPSc，而新生成的PrPSc聚合物在超声的作用下能够形成更小的寡聚体核心，为后续的构象转变过程提供新的seed，如此超声—孵育的循环过程就能够在较短周期内将PrPSc在样本中进行扩增[8]。不仅如此，Soto等人还证明了通过sPMCA扩增得到的PrPSc能够保留与seed一致的特性，如动物感染后的潜伏期、不同脑区海绵状损伤得分、PK酶抗性、Westernblotting检测特征条带等[9]。图2.sPMCA工作原理和模型图在sPMCA过程中，将少量的含有PrPSc的脑匀浆作为种子加入至未被感染的脑匀浆中共同孵育，诱导其中的PrPC转变为PrPSc，新生成的PrPSc聚合物在超声的作用下形成更小的寡聚体核心，为后续的构象转变过程提供新的seed。Fig.2TheprocessofsPMCAIntheprocessofsPMCA,asmallamountofbrainhomogenatecontainingPrPScisaddedasseedintotheuninfectedbrainhomogenateforco-incubation,whichcaninducePrPCconversionintoPrPSc.ThenewlyformedPrPScaggregatesformasmalleroligomercorebysonication,providingnewseedsforthesubsequentconformationtransitionprocess.由于具有传染性，朊病毒疾病可以在许多种属中发生。通常情况下，朊病毒在本种属中能够有效传播，被感染的动物能够在数周或数月内发病并短时间内全部死亡；但跨种属传播的效率则变得非常低，动物生存时间存在很大的个体差异，或者完全不能跨种属传播。这其中小鼠和仓鼠朊病毒的种属屏障现象是最为典型的例子之一。因此，sPMCA在研究朊病毒种属屏障中的优势就得到了充分体现，一方面能够忠实保留某一物种朊病毒的特性，另一方面又能够大幅缩短研究时间。Soto团队利用sPMCA，以小鼠和仓鼠脑匀浆为实验材料，实现了小鼠/仓鼠朊病毒的跨种属传播，并且分离得到了全新的
华东师范大学博士学位论文4正是由于sPMCA技术能够在体外将朊病毒变构过程量化进行，为了彻底证明朊病毒的遗传信息储存于自身构象中，利用大肠杆菌表达重组PrP并诱导其转变为具有致病性的构象成了关键一步。我们实验室于2010年突破性地在sPMCA体系中引入了脂类分子和RNA作为辅助因子（cofactor），成功地将细菌表达的重组小鼠PrP转变成为具有PK酶抗性的构象（PrP-res），同时还具有高度传染性，能够使野生型小鼠在短期内获得朊病毒疾病[11]。这是世界上第一个在体外从无至有（denovo）合成的重组小鼠朊病毒，通过颅内注射的方式，野生型小鼠的平均生存时间约为180天[11,12]；通过腹腔注射的方式，同样使小鼠获得了朊病毒疾病，其生存时间约为210天[13]。图3.以重组小鼠PrPC为底物从无至有地制备重组小鼠PrPSc在sPMCA体系中引入了脂类分子和RNA作为辅助因子，将重组小鼠PrPC转变为具有致病性的重组小鼠PrPSc。Fig.3DenovogenerationofPrPScusingrecombinantmousePrPCassubstrateInthepresenceoflipidandRNAascofactors,wegeneratedaprionusingrecombinantmouseprionprotein.可以看到sPMCA技术是现代研究朊病毒疾病中的一种重要手段。在本文中，我们将探究一些朊病毒研究领域尚未解决的问题：一方面，以重组PrP为对象，利用sPMCA重点探究不相同的氨基酸位点对小鼠/仓鼠朊病毒种属屏障的影响，并尝试获得能够跨种属屏障的过渡型朊病毒，进而制备重组仓鼠朊病毒；另一方面，我们将
本文编号：3548037
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