miR-302s重编程巴马香猪体细胞为诱导多能干细胞的初步研究

发布时间：2022-10-05 14:58

　　miR-302家族是胚胎干细胞（ESC）特异性的miRNA家族。研究发现miR-302s作为增强子可以提高体细胞重编程（SCR）效率,其单独使用可以获得人和小鼠诱导多能干细胞（i PSC）。目前对大家畜miR-302家族的序列和功能研究报道较少,仅有miR-302s促进SCR的研究。为了探讨miR-302家族在大家畜SCR过程中的功能及作用机制,本研究克隆了水牛miR-302s序列,并构建真核表达载体,将其应用于重编程巴马猪成纤维细胞（PFF）为诱导多能干细胞,重点探讨了四转录因子（OSKM）与miR-302s两种方法诱导PFF为多能干细胞进程中的细胞转变过程及相关基因表达的差异。研究结果如下:1.水牛miR-302s真核表达载体的构建克隆并构建了水牛miR-302s的慢病毒表达载体（bbu-miR-302s）,并进行生物信息学分析。测序结果显示,扩增获得的是水牛miR-302家族序列,其位于水牛7号染色体LARP7基因的内含子区域。miR-302家族成员之间以及miR-302家族在不同物种间均高度保守。预测水牛miR-302s主要靶基因共有255个,这些靶基因主要集中在33个通路中,... 

【文章页数】：144 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1 诱导多能干细胞研究进展
        1.1 诱导多能干细胞
        1.2 影响诱导多能干细胞的因素
            1.2.1 基因传递方式
            1.2.2 诱导培养条件
            1.2.3 供体细胞来源
            1.2.4 转录因子的选择
        1.3 诱导多能干细胞重编程的机理
        1.4 有蹄类家畜iPSC的研究进展
        1.5 iPSC与疾病模型
        1.6 iPSC与动物转基因工程
        1.7 大家畜iPSC存在的问题及前景展望
    2 miR-302s研究进展
        2.1 miR-302s的发现及作用机制
        2.2 miR-302s对诱导多能干细胞的作用
            2.2.1 miR-302s与DNA甲基化
            2.2.2 miR-302s与多能基因的表达
            2.2.3 miR-302s抑制细胞分化
            2.2.4 miR-302s抑制干细胞致瘤性
        2.3 miR-302s诱导多能干细胞的研究进展
    3 本研究目的与意义
第二章 水牛miR-302s载体构建及生物信息学分析
    摘要
    前言
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
        1.2 主要试剂与设备
            1.2.1 主要试剂
            1.2.2 主要仪器设备
            1.2.3 主要溶液配制
        1.3 试验方法
            1.3.1 卵巢组织基因组的提取
            1.3.2 水牛miR-302s前体序列扩增
            1.3.3 目的片段纯化及T-A克隆
            1.3.4 质粒转化
            1.3.5 bbu-miR-302s真核表达载体的构建及鉴定
            1.3.6 miR-302家族生物信息学分析
            1.3.7 数据库和分析软件
            1.3.8 细胞培养
            1.3.9 慢病毒包装及滴度测定
    2 结果
        2.1 水牛miR-302s真核表达载体的构建
        2.2 水牛miR-302s慢病毒真核载体的有效性检测
        2.3 bbu-mi R-302s基因家族生物信息学分析
            2.3.1 miR-302s基因家族序列及其在基因组中的定位
            2.3.2 bbu-miR-302s基因家族保守性及进化树分析
            2.3.3 miR-302s靶基因预测及生物信息学分析
    3 讨论
    4 小结
第三章 miR-302s重编程巴马香猪体细胞为多能干细胞的初步研究
    摘要
    前言
    1 材料与方法
        1.1 材料和试剂
            1.1.1 细胞
            1.1.2 质粒和菌种
        1.2 主要试剂与设备
            1.2.1 主要试剂
            1.2.2 主要仪器
            1.2.3 主要试剂配制
            1.2.4 引物设计及合成
        1.3 试验方法
            1.3.1 质粒提取
            1.3.2 细胞培养
            1.3.3 慢病毒包装及滴度测定
            1.3.4 病毒感染及诱导实验
            1.3.5 重编程效率检测
            1.3.6 piPSC的传代培养
            1.3.7 piPSC多能性基因以及三胚层基因检测
            1.3.8 免疫细胞荧光
            1.3.9 细胞增殖检测
            1.3.10 核型分析
            1.3.11 拟胚体实验
            1.3.12 统计分析
    2 结果
        2.1 质粒提取及鉴定
        2.2 miR-302s重编程巴马香猪成纤维细胞为诱导多能干细胞的研究
        2.3 miR-302s-piPSC多能性检测
        2.4 miR-302s-piPSC体外分化能力检测
        2.5 miR-302s-piPSC细胞倍增时间和核型分析
        2.6 miR-302s-piPSC与OSKM-piPSC的比较分析
            2.6.1 传统四因子(OSKM)重编程巴马香猪成纤维细胞为诱导多能干细胞
            2.6.2 OSKM-piPSC与miR-302s-piPSC多能性比较
            2.6.3 OSKM-piPSC与miR-302s-piPSC倍增时间比较
            2.6.4 OSKM-piPSC与miR-302s-piPSC重编程效率和多能基因表达量的比较研究
            2.6.5 OSKM-piPSC与miR-302s-piPSC继代培养能力的比较
    3 讨论
    4 小结
第四章 miR-302s重编程巴马猪成纤维细胞过程中间充质-上皮转化的研究
    摘要
    前言
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
        1.2 主要试剂及设备
            1.2.1 主要仪器
            1.2.2 主要试剂配制
            1.2.3 引物设计及合成
        1.3 试验方法
            1.3.1 细胞粘附测定
            1.3.2 免疫荧光检测肌纤维
            1.3.3 QRT-PCR检测基因表达变化
            1.3.4 统计分析
    2 结果
        2.1 miR-302s对巴马香猪成纤维细胞重编程进程中粘附能力的检测
        2.2 miR-302s对巴马香猪成纤维细胞重编程进程中应力纤维的影响
        2.3 miR-302s对巴马香猪体细胞重编程进程中MET/EMT分子标记基因的影响
        2.4 miR-302s与OSKM重编程进程中MET/EMT的比较分析
    3 讨论
    4 小结
第五章 不同重编程因子miR-302s与OSKM在巴马猪成纤维细胞重编程过程中差异表达基因的比较研究
    摘要
    前言
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
        1.2 主要试剂及设备
            1.2.1 主要试剂
            1.2.2 主要仪器
        1.3 试验方法
            1.3.1 不同重编程因子诱导巴马香猪成纤维细胞的制备
            1.3.2 RNA提取及质检
            1.3.3 文库构建
            1.3.4 上机检测
            1.3.5 测序原始数据质控及生物信息学分析
    2 结果
        2.1 总RNA的提取和质量检测
        2.2 转录组测序数据评估
            2.2.1 转录组测序原始数据评估
            2.2.2 转录组测序数据在参考基因组定位分析
            2.2.3 测序数据的饱和度和Reads覆盖度
            2.2.4 样品间相关性分析
        2.3 差异表达基因分析
            2.3.1 不同重编程因子对巴马香猪重编程过程中差异基因的比较研究
            2.3.2 重编程因子OSKM与miR-302s对巴马香猪重编程过程中作用机制的研究
    3 讨论
    4 小结
全文总结
参考文献
附录 中英文缩略词表
致谢
攻读学位期间发表论文情况



本文编号：3685990