雷公藤次碱对东方粘虫肌肉组织的影响及其分子靶标研究

发布时间：2022-10-06 20:29

　　生物碱是杀虫植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）的主要活性成分,包括雷公藤次碱、雷公藤吉碱、雷公藤精碱和雷公藤春碱等。其中,雷公藤次碱的杀虫活性最强,对东方粘虫Mythimna separata Walker、小菜蛾Plutella xylostella及菜青虫Pieris rapae等多种害虫均具有较好的麻痹致死作用。随着雷公藤生物碱生物合成研究方面的突破,使得产业化制备雷公藤生物碱以用于生产雷公藤杀虫剂成为可能。然而,雷公藤次碱的杀虫机理尚不清楚,限制了该优秀杀虫剂的进一步开发和应用。前期症状学观察表明雷公藤总生物碱及次碱均可引起东方粘虫幼虫瘫软、麻痹、死亡,且明显引起体壁肌病变,初步推测其作用靶标可能存在于昆虫的肌肉系统,可能是新型神经-肌肉毒剂。鉴于此,本研究以雷公藤次碱为研究对象,以东方粘虫为供试昆虫,以商品化神经-肌肉毒剂氯虫苯甲酰胺为对照药剂,采用透射电镜观察了雷公藤次碱对粘虫肌肉组织结构的影响;进一步利用激光共聚焦显微技术测定了胞内钙离子动力学变化;在此基础之上,研究了雷公藤次碱引起的粘虫转录组水平的变化,并采用RNAi技术验证了候... 

【文章页数】：191 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 文献综述
    1.1 植物源杀虫剂作用机理研究进展
        1.1.1 植物源杀虫剂概述
        1.1.2 植物源杀虫剂作用靶标多样性和特殊性
    1.2 作用于昆虫肌肉系统的杀虫剂及其机理
        1.2.1 昆虫的肌肉系统
        1.2.2 细胞内的钙稳态及调节机制
        1.2.3 杀虫剂对昆虫肌肉系统的影响
    1.3 雷公藤生物碱的杀虫作用研究进展
        1.3.1 雷公藤生物碱化学
        1.3.2 雷公藤生物碱的杀虫活性
        1.3.3 雷公藤生物碱的杀虫机理
    1.4 问题的提出及论文设计思路
第二章 雷公藤次碱对东方粘虫的致毒症状及组织病理学影响
    2.1 材料与方法
        2.1.1 供试材料
        2.1.2 主要仪器及设备
        2.1.3 试验方法
    2.2 结果与分析
        2.2.1 雷公藤次碱对粘虫的胃毒毒力
        2.2.2 雷公藤次碱对粘虫的致毒症状
        2.2.3 雷公藤次碱对粘虫的组织病理学影响
    2.3 讨论
    2.4 小结
第三章 雷公藤次碱对粘虫肌细胞毒力及胞内钙离子浓度的影响
    3.1 材料与方法
        3.1.1 供试材料
        3.1.2 主要仪器设备
        3.1.3 试验方法
        3.1.4 数据统计与分析
    3.2 结果与分析
        3.2.1 肌细胞存活率及形态观察
        3.2.2 雷公藤次碱对原代培养肌细胞的毒力
        3.2.3 雷公藤次碱对肌细胞膜LDH漏出率的影响
        3.2.4 雷公藤次碱对肌细胞形态及发育的影响
        3.2.5 细胞外钙存在时,雷公藤次碱对胞内[Ca~(2+)]i的影响
        3.2.6 细胞外钙存在/缺乏时,雷公藤次碱对胞内[Ca~(2+)]i的影响
        3.2.7 雷公藤次碱对肌质网Ca~(2+)释放通道的影响
        3.2.8 雷公藤次碱对鱼尼丁受体(RyR)Ca~(2+)释放通道的影响
        3.2.9 雷公藤次碱对三磷酸肌醇受体(IP_3R)Ca~(2+)释放通道的影响
    3.3 讨论
        3.3.1 雷公藤次碱的作用靶标位于昆虫的肌细胞
        3.3.2 肌质网上的钙通道可能是雷公藤次碱的作用靶标
    3.4 小结
第四章 雷公藤次碱对粘虫转录组水平的影响及基因表达分析
    4.1 材料与方法
        4.1.1 供试材料
        4.1.2 试验方法
        4.1.3 数据统计与分析
    4.2 结果与分析
        4.2.1 粘虫总RNA提取
        4.2.2 原始数据处理及EST拼接
        4.2.3 编码蛋白框(CDS)预测及基因功能注释
        4.2.4 KOG、GO及Pathway分析
        4.2.5 差异基因表达分析
        4.2.6 主要杀虫剂靶标基因鉴定
        4.2.7 雷公藤次碱对粘虫基因表达量的影响
        4.2.8 qRT-PCR验证转录组测序结果
        4.2.9 雷公藤次碱对肌肉收缩/舒张相关基因表达的影响
    4.3 讨论
        4.3.1 转录组测序可为研究雷公藤次碱的杀虫分子机制奠定基础
        4.3.2 雷公藤次碱杀虫作用与细胞内钙离子浓度失衡有关
        4.3.3 雷公藤次碱和氯虫苯甲酰胺的杀虫分子机理的异同
    4.4 小结
第五章 粘虫鱼尼丁受体基因全长获取及表达谱分析
    5.1 材料与方法
        5.1.1 供试材料
        5.1.2 仪器设备
        5.1.3 试验方法
        5.1.4 数据统计与分析
    5.2 结果与分析
        5.2.1 粘虫RyR基因目的片段获取
        5.2.2 粘虫RyR核酸序列分析
        5.2.3 粘虫RyR氨基酸序列分析
        5.2.4 粘虫RyR基因编码氨基酸多重序列比较
        5.2.5 进化树分析
        5.2.6 粘虫RyR基因在不同发育阶段的表达量
        5.2.7 粘虫RyR在不同组织的表达量
    5.3 讨论
        5.3.1 不同物种鱼尼丁受体同源性存在差异
        5.3.2 鱼尼丁受体基因在粘虫不同发育阶段和不同组织表达存在差异
    5.4 小结
第六章 RyR基因在雷公藤次碱杀虫作用中的功能鉴定
    6.1 材料与方法
        6.1.1 供试材料
        6.1.2 主要设备及试剂
        6.1.3 试验方法
        6.1.4 数据统计与分析
    6.2 结果与分析
        6.2.1 MsRyR基因片段PCR
        6.2.2 体外dsRNA合成
        6.2.3 dsRNA对试虫死亡率和体重的影响
        6.2.4 dsRNA对基因表达量的影响
        6.2.5 雷公藤次碱对RNAi处理粘虫的影响
    6.3 讨论
        6.3.1 鱼尼丁受体在昆虫生长发育中发挥着重要作用
        6.3.2 鱼尼丁受体是雷公藤次碱的作用靶标之一
    6.4 小结
第七章 粘虫RyR同源模建及与雷公藤次碱分子对接
    7.1 材料与方法
        7.1.1 供试材料
        7.1.2 试验方法
    7.2 结果与分析
        7.2.1 MsRyRNTD同源模建及评估
        7.2.2 MsRyRSPRY1同源模建及评估
        7.2.3 MsRIH1同源模建及评估
        7.2.4 MsRIH2同源模建及评估
        7.2.5 氯虫苯甲酰胺和雷公藤次碱与MsRyRNTD对接
        7.2.6 氯虫苯甲酰胺和雷公藤次碱与MsRyRSPRY1对接
        7.2.7 氯虫苯甲酰胺和雷公藤次碱与MsRIH对接
    7.3 讨论
        7.3.1 雷公藤次碱和氯虫苯甲酰胺在各预测结合口袋的结合能力存在差异
        7.3.2 雷公藤次碱的作用位点可能存在于MsRIH2和MsRyRNTD上
    7.4 小结
第八章 讨论与结论
    8.1 讨论
        8.1.1 RyR和IP3R是雷公藤次碱的重要作用靶标
        8.1.2 雷公藤次碱和氯虫苯甲酰胺在RyR上的结合位点可能不同
        8.1.3 雷公藤次碱的作用机理推测
    8.2 结论
    8.3 本研究创新点
    8.4 有待进一步解决的问题
参考文献
附录
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]双氧木脂素E对东方粘虫幼虫体壁肌超微结构及Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase的影响[J]. 肖新敏,胡兆农,姬志勤,魏少鹏,吕敏,师宝君,吴文君.  农药学学报. 2017(04)
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[3]Design, synthesis and insecticidal activities of novel 1-substituted-5-（trifluoromethyl）-1H-pyrazole-4-carboxamide derivatives[J]. Zhi-Bing Wu,Xiang Zhou,Yi-Qiang Ye,Pei-Yi Wang,Song Yang.  Chinese Chemical Letters. 2017(01)
[4]昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的代谢抗性机制研究进展[J]. 陈澄宇,史雪岩,髙希武.  农药学学报. 2016(05)
[5]小菜蛾抑制性谷氨酸受体的RNA干扰[J]. 施秀珍,郭兆将,朱勋,王少丽,徐宝云,谢文,张友军,吴青君.  昆虫学报. 2012(12)
[6]氯虫苯甲酰胺对小菜蛾鱼尼丁受体基因mRNA表达量的影响[J]. 孙丽娜,杨代斌,芮昌辉,崔丽,袁会珠.  农药学学报. 2012(02)
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[8]植物乙酰乳酸合成酶抑制剂作用方式及机理研究进展[J]. 于澄宇,何蓓如.  农药学学报. 2011(03)
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博士论文
[1]氟苯虫酰胺和NK130102对亚洲玉米螟的分子作用机理研究[D]. 崔丽.中国农业科学院 2014
[2]雷公藤总生物碱杀虫作用研究[D]. 周琳.西北农林科技大学 2007
[3]不同类杀虫药剂的致毒症状与作用机理关系研究[D]. 马志卿.西北农林科技大学 2002

硕士论文
[1]赤拟谷盗两种细胞内钙离子通道基因的克隆及RNA干扰研究[D]. 刘亚萍.扬州大学 2014
[2]雷公藤生物碱对昆虫肌质网钙泵的影响[D]. 谭浩.西北农林科技大学 2010



本文编号：3687358