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鸡内源性反转录病毒ALVE1的天然免疫功能及分子机制

发布时间:2023-06-01 19:19
  DNA甲基化抑制剂5-Aza-2’-Deoxycytidine(5-Aza-dC)是第一个被美国FDA批准,用于治疗人类急性粒细胞白血病的表观修饰药物之一,它能与DNA甲基转移酶DNMT竞争性结合抑制其活性,阻断抑癌基因DNA甲基化反应,是广谱抗肿瘤药物。最新研究表明,在结肠癌和卵巢癌中,5-Aza-dC可激活内源性反转录病毒(ERV)来诱导Ⅰ型干扰素反应,进而发挥抗肿瘤作用。禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)诱发的慢性传染性肿瘤病,对家禽业危害巨大。禽白血病的防治,一直是困扰家禽业的世界性难题。本研究发现,DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC同样具有激活内源性反转录病毒进而抑制禽白血病病毒ALVJ的功能。由于ERV大多因为突变、缺失而失去编码蛋白的能力,是体内重要的长非编码RNA来源。那么,5-Aza-dC是否通过诱导ERV产生的长非编码RNA来发挥抗肿瘤抗病毒的功能呢?基于以上科学问题,主要研究内容如下:(1)DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC具有抑制禽白血病病毒ALVJ的功能。本研究先用禽白血病病毒ALVJ感染鸡胚成纤维细胞CEF 24 h,再通过5 μM 5-Aza-dC处理感染...

【文章页数】:118 页

【学位级别】:博士

【文章目录】:
中文摘要
Abstract
符号说明
第一章 文献综述
    1 内源性反转录病毒研究进展
        1.1 内源性反转录病毒概述
        1.2 内源性反转录病毒作用机制
        1.3 内源性反转录病毒的天然免疫功能
    2 长链非编码RNA研究进展
        2.1 长链非编码RNA概述
        2.2 长链非编码RNA作用机制
        2.3 长链非编码RNA的天然免疫功能
    3 DNA甲基转移酶抑制剂研究进展
        3.1 DNA甲基转移酶抑制剂概述
        3.2 DNA甲基转移酶抑制剂对基因表达的影响
    4 研究目的和意义
第二章 DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC激活鸡内源性反转录病毒并抑制ALVJ感染
    1 前言
    2 材料
        2.1 细胞与病毒
        2.2 主要试剂
        2.3 主要仪器
    3 方法
        3.1 鸡胚成纤维细胞的制备
        3.2 5-Aza-dC处理鸡胚成纤维细胞
        3.3 共聚焦间接免疫荧光试验
        3.4 总蛋白提取
        3.5 Western blot
        3.6 总RNA提取
        3.7 转录组测序
        3.8 cDNA合成和qRT-PCR
    4 结果与分析
        4.1 5-Aza-dC处理鸡胚成纤维细胞浓度筛选
        4.2 5-Aza-dC抑制J亚群禽白血病病毒增殖和入侵
        4.3 RNA-Seq测序数据与质量评估
        4.4 RNA-Seq结果验证
        4.5 去甲基化试剂5-Aza-dC激活天然免疫相关基因表达
        4.6 去甲基化试剂5-Aza-dC激活鸡内源性反转录病毒表达
    5 讨论
第三章 源于鸡内源性反转录病毒ALVE1的lnc-ALVE1-AS1的鉴定
    1 前言
    2 材料
        2.1 细胞与载体
        2.2 主要试剂
        2.3 主要仪器
    3 方法
        3.1 总RNA提取及纯化
        3.2 RACE快速扩增转录子两端序列
        3.3 Northerblot试验
        3.4 生物信息学分析
        3.5 RNA FISH试验
        3.6 转录子编码蛋白能力验证
        3.7 细胞转染
        3.8 Westernbolt
    4 结果与分析
        4.1 5'RACE和3'RACE鉴定转录子全长
        4.2 Northern blot鉴定转录子
        4.3 生物信息学预测转录子编码能力和二级结构
        4.4 体外实验验证转录子编码能力
        4.5 RNA FISH鉴定lnc-ALVE1-AS1亚细胞定位
    5 讨论
第四章 长链非编码RNA lnc-ALVE1-AS1的天然免疫功能及分子机制
    1 前言
    2 材料
        2.1 细胞、载体与病毒
        2.2 主要试剂
        2.3 主要仪器
    3 方法
        3.1 lnc-ALVE1-AS1过表达载体构建
        3.2 细胞转染
        3.3 qRT-PCR
        3.4 lnc-ALVE1-AS1 RNAi干扰试验
        3.5 ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)
        3.6 共聚焦免疫荧光
        3.7 RNA Pulldown
        3.8 WesternBlot
        3.9 RNA FISH
        3.10 TLR3干扰试验
        3.11 TLR3信号抑制试验
    4 结果与分析
        4.1 lnc-ALVE1-AS1过表达重组质粒的构建
        4.2 lnc-ALVE1-AS1激活I型干扰素信号转录因子表达
        4.3 干扰lnc-ALVE1-AS1抑制干扰素刺激基因表达
        4.4 lnc-ALVE1-AS1抑制禽白血病病毒ALVJ增殖
        4.5 lnc-ALVE1-AS1影响胞内核酸识别因子的表达水平
        4.6 TLR3是lnc-ALVE1-AS1发挥天然免疫抗病毒反应的核酸识别因子
    5 讨论
全文结论
主要创新点
进一步研究展望
参考文献
附录
致谢
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本文编号:3826888

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