甲基苯丙胺诱导的心肌凋亡及纤维化机制初探

发布时间：2017-12-30 01:00

本文关键词：甲基苯丙胺诱导的心肌凋亡及纤维化机制初探　出处：《南方医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景:甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)是一种新型合成类毒品,易溶于水和酒精,其具有苯环结构,与儿茶酚胺类神经递质结构极其相似,因外观似冰,俗称“冰毒”,是最为常见的合成类毒品。过去几年,METH的缉获量占每年全球苯丙胺类兴奋剂缉获量的最大份额,因其见效快,兴奋持续时间久,合成技术简单,目前已成为全球第二个使用最为广泛的非法药物。目前全球METH滥用者人数估计有3300万,而我国自上世纪九十年代以来,METH滥用情况也变的日益严峻,呈现出区域逐渐扩大、滥用率急剧增长、年龄结构低龄化等特点,METH的滥用不仅严重损害了其自身的健康,而且引发了一系列社会案件,在社会上产生了严重的负面影响。在日常法医实践工作中,也遇到不少因METH滥用引起的死亡案例。因此,METH引起的毒性损伤研究已经成为世界性的研究热点。METH在给人们带来短暂的精神和身体的快感和愉悦之余,直接的副作用就是对身体和健康的带来巨大损害。研究表明,吸食METH能产生很多不利的反应,包括神经毒性,神经心理缺陷以及心血管毒性。其对神经和心血管的巨大作用是通过介导释放单胺类神经递质所致,包括多巴胺,去甲肾上腺素和5-羟色胺。随着METH滥用的加剧,其对心血管损伤的报道也不断增加,长期滥用METH后,除了对人体的神经系统产生严重不良后果外,心血管系统也会出现严重的病理损害,导致诸多疾病的发生,急性METH中毒可以激活交感神经系统,引起心律失常和高血压。长时间吸食METH可引起心肌梗死、冠心病、心肌纤维化和主动脉夹层等,因而也越来越受到研究者们的关注。临床观察和尸体检查结果显示,METH滥用者导致严重心血管疾病,如心律失常、心肌缺血、主动脉夹层、高血压,甚至肥厚性心肌病、急性冠脉综合症、充血性心力衰竭,甚至引发心脏性死亡。研究表明,METH处理后能够导致儿茶酚胺类物质如去甲肾上腺素的释放,它的释放后能直接刺激心脏α受体,能够增强胶原纤维的表达,导致纤维化的发生,其次儿茶酚胺的释放过载能够导致血管痉挛,缺血,活性氧产生以及线粒体损伤等等,有报道称METH作用心肌细胞后,最先发生的是线粒体功能障碍。结合上述研究,综合科室前期研究的基础上,本课题拟在现有模型处理方式方法的基础上,摸索建立METH诱导心肌纤维化的动物模型,同时从动物实验和细胞实验的水平,进一步探讨METH诱导心肌凋亡的分子机制。本课题拟通过建立METH中毒的体内动物模型及体外细胞模型,初步探讨METH诱导的心肌纤维化及心肌凋亡的作用机制,探索METH诱导的心肌纤维化动物模型的建立,通过iTRAQ技术寻找差异基因,为后续的机制研究奠定基础。在已有的动物模型上,研究PUMA(p53上调凋亡调制物,p53upregulated modulator of apoptosis)在METH诱导的心肌凋亡中的作用机制,并在原代心肌细胞上进行验证,通过蛋白组学及免疫荧光技术,检测相关蛋白表达变化及凋亡情况。最终完成METH诱导纤维化模型的建立及初步阐明PUMA在心肌凋亡中的作用,为METH诱导心脏毒性损伤机制研究及基因干预治疗提供理论依据目的:通过建立METH中毒的体内动物模型及体外细胞模型,初步探讨METH诱导的心肌纤维化及心肌凋亡的作用机制,探索METH诱导的心肌纤维化动物模型的建立,通过iTRAQ技术寻找差异基因,为后续的机制研究奠定基础。在已有的动物模型上,研究PUMA在METH诱导的心肌凋亡中的作用机制,并在原代心肌细胞上进行验证,通过蛋白组学及免疫荧光技术,检测相关蛋白表达变化及凋亡情况。最终完成METH诱导纤维化模型的建立及初步阐明PUMA在心肌凋亡中的作用,为METH诱导心脏毒性损伤机制研究及基因干预治疗提供理论依据方法:第一部分:METH诱导的心肌纤维化模型的建立1.异丙肾上腺素给药浓度及给药时间的确定选择180g-200gSD雄性大鼠,设立O.1mg/kg,0.5mg/kg两个浓度梯度,分为三天组和五天组,通过MASSON染色选出最合适的异丙肾上腺素的浓度。2.通过MASSON染色检测纤维化程度选择180g-200gSD雄性大鼠,设立对照组,异丙肾上腺素组,METH组,异丙肾上腺素+METH组四组,对照组等量生理盐水注射,异丙肾上腺素加METH组上午10:00注射异丙肾上腺素(0.1mg/kg),下午14:00和19:00腹腔注射METH(5mg/kg),连续注射30天,取心脏组织固定,进行MASSON染色。3.通过iTRAQ技术检测差异蛋白给药结束后,第二天与给药同一时间处死老鼠,并立即取新鲜的的心尖部组织,放于-80℃,每组取9份心尖部组织,随机组合为3组,通过iTRAQ技术检测差异蛋白。第二部分:PUMA在METH诱导的心脏凋亡中的作用1.METH中毒原代心肌细胞模型及动物模型的建立(1)原代心肌细胞培养。取出生1～3天的SD乳鼠,快速提取心肌组织,0.2%胰酶孵育过夜,利用Ⅱ型胶原酶消化细胞,回收悬液,离心后加入高糖DMEM,混匀后接种于1Ocm培养皿中,90分钟后回收培养液,计数后接种于6孔板中,接种密度4～6×105,37℃和5%CO2条件下培养,待细胞密度达到70%时,分别使用0mmol/L、0.3mmol/L、0.6mmol/L、0.9mmol/L、1.2mmol/L、1.5mmol/L METH的10%FBS的DMEM培养基培养24小时后,然后提取细胞总蛋白,Western Blot检测细胞PUMA蛋白的表达变化情况,以此选取合适浓度建立细胞中毒模型。(2)通过上述实验,选取合适的METH浓度,以该浓度METH溶液分别处理0小时、2小时、4小时、8小时、16小时、24小时,以此建立细胞中毒模型。处理结束后,提取细胞总蛋白,Western Blot检测细胞PUMA蛋白的表达变化情况,以此选择合适的METH作用时间。(3)参考文献报道及本科室前期造模方法,建立METH中毒动物模型,我们选择200g-250gSD雄性大鼠,腹腔注射METH,建立大鼠亚急性(15mg/kg,每12小时注射1次,共注射8次)及慢性中毒模型(梯度增加至5mg/kg,连续注射14天),末次注射后2小时处死动物,提取心肌组织蛋白,western blot检测PUMA及线粒体凋亡通路相关标志蛋白(Bc12和Bax)的表达情况。2.PUMA在METH诱导的心肌细胞凋亡中的作用(1)设计针对心肌细胞的PUMA siRNA干扰片段,使用lipo 3000脂质体转染的方法处理细胞,Western Blot检测细胞PUMA蛋白的表达情况,以此选出有效的干扰片段。(2)在上述实验的基础上,将心肌细胞分为6组,分别为空白对照组(Ctrl)、对照+小干扰组1(siPUMA#1)、对照+小干扰组2(siPUMA#2)、给药组(METH)、给药+小干扰组1(siPUMA#1)、给药+小干扰组2(siPUMA#2),处理24小时后,收集细胞蛋白检测PUMA、Caspase3、PARP表达情况。(3)TUNEL染色法检测各组细胞凋亡情况。3.PUMA通过线粒体途径介导METH诱导的心肌细胞凋亡(1)检测上述各组细胞Bcl-2和Bax表达情况,判断Bax/Bcl-2比值变化情况。(2)分别提取上述各组细胞胞浆及线粒体内蛋白,检测细胞胞浆及线粒体内Cyt c表达变化情况。结果:第一部分:METH诱导的心肌纤维化模型的建立1.异丙肾上腺素给药浓度及给药时间的确定异丙肾上腺素在0.1mg/kg三天组已经出现纤维增生性改变,0.1mg/kg五天组出现明显的纤维增生性改变,浓度越高,时间越长,纤维改变的程度越重。通过比较,我们最终确定异丙肾上腺素使用方法为0.1mg/kg三天。2.各组MASSON染色结果设定的四组中,METH和异丙肾上腺素组纤维化出现的程度最重,单纯的异丙肾上腺素组和METH组在心肌细胞间隙能看到纤维增生性改变,但程度不重,生理盐水组未看到纤维化改变。3.iTRAQ蛋白分析结果iTRAQ技术差异蛋白分析结果是,单纯METH组纤维化相关蛋白Collagen3a1 和 Fibnection 表达均上调。第二部分:PUMA在METH诱导的心脏凋亡中的作用1.METH中毒原代心肌细胞模型及动物模型的建立(1)分别以 Ommol/L、0.3mmol/L、0.6mmol/L、0.9mmol/L、1.2mmol/L 和1.5 mmol/L METH溶液处理原代心肌细胞,Western Blot结果显示PUMA随着METH浓度的升高,其表达量呈现先增高后降低的趋势,其中PUMA的表达量在0.9 mmol/L组与Ommol/L组相比,升高的最为明显。(2)用0.9mmol/LMETH溶液分别处理原代心肌细胞0小时、2小时、4小时、8小时、16小时、24小时,Western Blot结果显示PUMA随着METH处理时间的延长,其表达量也逐渐升高,其中PUMA的表达量在2小时开始升高,在16小时达到峰值。2.PUMA在METH诱导的心肌细胞凋亡中的作用(1)使用特异性siRNA干扰片段后发现,相对于单独使用METH组来说,PUMA蛋白表达下降。使用METH+siPUMA#1及METH+siPUMA#2后,PUMA的表达量较METH组均有显著下降。同时检测凋亡Maker基因(Caspase-3和PARP),结果显示,与Ctrl组相比,METH组Caspase3和PARP蛋白表达均增加;而METH+siRNA与METH组相比,Caspase3和PARP蛋白表达量降低。(2)TUNEL法检测各组的细胞凋亡情况,结果发现,单纯的siPUMA#1、siPUMA#2组与Ctrl组相比没有显著差异,而METH组中细胞总凋亡阳性数明显增加,METH+siRNA与METH组相比,两组细胞均有明显降低。3.PUMA通过线粒体途径介导METH诱导的心肌细胞凋亡(1)使用特异性siPUMA干扰片段后,分给药及不给药处理24小时后,Western Blot方法检测Bcl-2和Bax蛋白发现,与Ctrl组相比,METH组Bax表达升高,而Bcl-2表达降低,Bax/Bcl-2比值升高;而METH+siRNA与METH组相比发现这种效应被逆转,Bax表达降低,而Bcl-2表达升高,Bax/Bcl-2比值降低。(2)使用特异性siPUMA干扰片段后,分给药及不给药处理24小时后,分别提取胞浆蛋白及线粒体蛋白,Western Blot方法检测细胞色素C蛋白,检测后发现,与Ctrl组相比,METH组线粒体内的细胞色素C表达减少,而胞浆中细胞色素C表达增多;而METH+siRNA与METH组相比,线粒体内的细胞色素C表达增多,而胞浆中细胞色素C表达减少。结论:第一部分:METH诱导的心肌纤维化模型的建立1.METH与异丙肾上腺素合用时,异丙肾上腺素的使用方法为0.1mg/kg三天2.异丙肾上腺素能够诱导心脏纤维化,与METH合用具有协同作用,诱导心肌纤维化。3.iTRAQ技术差异蛋白分析结果是,单纯METH组纤维化相关蛋白Collagen3al 和 Fibnection 表达均上调第二部分:PUMA在METH诱导的心脏凋亡中的作用1.在METH处理的细胞及动物模型中,PUMA表达均升高。2.METH处理后,原代心肌细胞及心肌组织的凋亡均升高;细胞模型中,敲低PUMA表达后,凋亡降低。3.METH处理原代心肌细胞后,Bax表达升高,Bcl-2表达降低;敲低PUMA后,Bax表达降低,而Bcl-2表达升高。4.METH处理原代心肌细胞后,细胞色素C从线粒体内流出胞浆增多;敲低PUMA后,阻止了细胞色素C从线粒体内流出胞浆增多。5.METH处理原代心肌细胞后,Caspase3、PARP表达增加,敲低PUMA后,Caspase3、PARP表达下降。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：D919

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