家蚕围食膜因子鉴定及其在BmNPV入侵中的功能研究

发布时间：2018-03-19 15:13

  本文选题：家蚕　切入点：围食膜因子　出处：《西南大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：昆虫中肠含有一层具有一定弹性和韧性的非细胞结构的半透性膜——围食膜(peritrophin membrane,PM),由中肠上皮细胞分泌形成,在整个中肠区域形成sleeve-like结构。昆虫围食膜的结构复杂,组分多样,其中蛋白质是PM的主要成分。围食膜因子是围食膜蛋白中至少含有一个几丁质结合结构域(chitin binding domain,CBD)且能在强变性剂(尿素、盐酸胍等)作用下可被移除的外周蛋白。研究报道围食膜因子在抵抗外源病原物的入侵过程中发挥着重要作用。本研究基于家蚕全基因组数据库,利用同源性搜索和结构域搜索共鉴定了11个围食膜因子基因,并对围食膜因子基因进行生物信息学分析。在信息学分析和基因时空表达分析基础上选定2个在中肠特异表达的围食膜因子Bm001504和Bm009641基因,研究其在外援病原物感染过程中的功能。分析家蚕幼虫食下BmNPV后不同时间点的中肠基因表达,发现Bm001504和Bm009641基因的表达呈显著变化。构建两个基因的过表达载体,检测细胞水平过表达基因后对BmNPV增殖复制的影响,发现过表达Bm001504和Bm009641基因均能抑制BmNPV的增殖复制。在个体水平对Bm001504基因分别敲除和过表达后,检测BmNPV对转基因系家蚕的影响。研究结果如下:1、家蚕围食膜因子的基因鉴定及生物信息学分析本文利用同源性搜索和结构域搜索在家蚕全基因组数据库中共鉴定了40个同源基因。去除3个含Glyco_hydro_18保守结构域的几丁质酶、4个含mucin结构域的肠粘蛋白、3个含Polysacc_deac_1保守结构域的几丁质去乙酰基酶、13个含有一个CBD的类围食膜因子表皮蛋白CPAP1以及6个含有3个CBDs的CPAP3后,最终得到11个围食膜因子基因。系统发生分析发现围食膜因子基因中同一基因的不同CBDs多聚为一簇。与赤拟谷盗中围食膜因子基因中CBD的多重序列比对发现半胱氨酸残基之间氨基酸的数目符合以下模式:CX11-17CX5CX9-14CX12CX6-7C。2、家蚕围食膜因子的基因表达利用本实验室已有芯片表达数据对家蚕围食膜因子基因的时空表达模式进行分析,发现Bm001504、Bm009641、Bm011851在幼虫期中肠特异高量表达,且食下感染BmNPV后表达显著上调。RT-PCR结果与芯片表达数据相似。推测Bm009641和Bm001504基因参与BmNPV感染,选定为研究的靶标基因。克隆两个基因全长,其编码氨基酸有信号肽且有多个N-和O-连接糖基化位点。qRT-PCR检测家蚕幼虫食下Bm NPV后基因表达变化,发现Bm001504基因在感染BmNPV6h、8h、12h、24h、72h后上调表达,Bm009641基因在感染BmNPV6h、8h、24h上调表达,显示两个基因可能在BmNPV的入侵中有重要功能。3、家蚕围食膜因子基因在BmNPV入侵中的功能研究分别构建Bm001504和Bm009641基因的真核表达载体,细胞水平过表达Bm001504和Bm009641基因后检测对BmNPV增殖复制的影响,发现处理组与对照组相比,BmNPV增殖复制必需基因ie1、vp39和p10的表达量均显著降低,表明Bm001504、Bm009641基因在细胞水平可抑制病毒的增殖复制。在个体水平过表达和敲除Bm001504基因后,检测转基因系家蚕感染BmNPV后幼虫存活率及对Bm NPV增殖复制的影响,发现过表达Bm001504基因后转基因家蚕幼虫感染BmNPV后的存活率显著升高,病毒关键基因ie1、vp39和p10的表达量显著降低;敲除Bm001504基因后家蚕幼虫感染BmNPV后的存活率显著降低,病毒关键基因ie1、vp39和p10的表达量显著升高。研究发现Bm001504和Bm009641基因在保护家蚕免受外源病原微生物的感染过程中发挥了重要抑制作用,其作用机制有待后续研究。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S884.51;S881.2

【参考文献】

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本文编号：1634819