红苞凤梨金边嵌合体白化细胞叶绿素合成限速基因挖掘

发布时间：2017-03-21 23:12

  本文关键词：红苞凤梨金边嵌合体白化细胞叶绿素合成限速基因挖掘，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本文以红苞凤梨金边嵌合体扦插植株以及组织培养所获得的全绿、全白植株为典型材料,通过DNA-AFLP分子标记分析和转录组测序分析,并结合叶绿素合成前体物质含量测定,寻找红苞凤梨金边嵌合体白化细胞与绿色细胞在基因组DNA水平和mRNA转录水平上的差异,挖掘白化细胞叶绿素合成的关键限速基因,并利用Reeal time PCR技术对关键基因进行表达模式分析,进一步验证其可能功能。获得的主要研究结果如下：1.建立了一套较为稳定完善的红苞凤梨DNA-AFLP分析技术体系,包括DNA提取、银染、和显影,并利用该体系对红苞凤梨组培全绿植株和全白植株进行了检测。本研究随机选用69对AFLP引物对红苞凤梨组培全绿和全白植株进行选择性扩增,选择性扩增结果显示,红苞凤梨组培全绿苗与全白苗的扩增条带一致,并没有存在多态性条带。红苞凤梨组培全绿苗与全白苗在我们使用的69对引物间并未发现基因组DNA长度的显著差异。2.以红苞凤梨嵌合体植株的叶、茎、根及带红晕叶片为材料,通过RNA-seq测序,得到初始reads 23.5M对,总碱基数为4.76 Gb。在测序质量值统计评估方面,平均Q20为100%,碱基Q30为93.54%,GC含量为50.33%。通过对原始数据的过滤并利用Trinity软件进行拼接,共得到41,052条Unigenes,平均长度为877.62bp。与公共数据库进行比对,共有23,275条unigenes比对到NCBI数据库,23,134条unigenes比对到Swiss-Port数据库。其中,比对到GO和COG数据库的unigenes分别为17,748和8,505条,共有5825条Unigenes被KEGG注释参与到117个KEGG代谢通路,其中参与到卟啉和叶绿素代谢途径(Ko号：Ko00860)的Unigene共有39条。3.红苞凤梨金边嵌合体绿叶部分的叶绿素a含量和叶绿素b含量及总叶绿素含量分别为为白叶部分的35.2倍、16.7倍和24.18倍,说明白色叶叶绿素合成受阻,叶绿素含量显著下降。叶绿素合成中间代谢物6-氨基乙酰丙酸(ALA)含量和胆色素原(PBG)含量在绿叶与白叶间无显著差异,但自尿卟啉原Ⅲ(Uroporphyrinogen Ⅲ)开始白叶含量极显著减少,绿叶Uro Ⅲ含量是白叶的4.7倍。同时,之后的粪卟啉原Ⅲ(CoprogenⅢ)、原卟啉Ⅸ (ProtoIX)、镁原卟啉Ⅸ (Mg-ProtoIX)、原脱植基叶绿素(Pchlide)含量在白叶中均极显著低于绿叶,说明PBG到Uro Ⅲ的转化是红苞凤梨白化细胞叶绿素合成受阻的限速步骤。4.本实验以5对可以扩增出清晰条带,无引物二聚体和非特异性扩增的候选内参基因在红苞凤梨绿叶、白叶样品中进行Real time qPCR扩增,采用geNorm和NormFinder两个软件进行候选内参基因表达稳定性分析,结果显示18S rRNA为红苞凤梨叶片组织中表达最稳定的内参基因。5.采用Real time qPCR对叶绿素合成代谢途径的12个基因(hemA、hemB、hemC、 hemD、hemE、hemG、hemH、CAO、ACC、ChlD、Chlll、ChlM)在红苞凤梨组培全绿苗和全白苗中的表达模式进行检测。结果显示,一共有7个基因相对于全绿苗在全白苗中表达受抑,分别是hemA、hemC、hemE、CAO、ACC、ChlD。催化PBG到Uro Ⅲ转化的hemC可能在白化细胞失绿中起关键作用,为红苞凤梨金边嵌合体白化细胞叶绿素合成关键限速基因。
【关键词】：红苞凤梨 白化失绿 叶绿素合成 限速基因
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S682.36
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 缩略词表7-11
• 前言11-12
• 1 文献综述12-17
• 1.1 植物嵌合体及形成方式12-13
• 1.1.1 植物嵌合体概述12
• 1.1.2 植物嵌合体形成方式12-13
• 1.2 植物白化细胞失绿的分子机制13-15
• 1.2.1 叶绿素代谢途径受阻13-14
• 1.2.2 叶绿体分化与发育相关基因的突变14
• 1.2.3 核-质互作效应导致失绿14
• 1.2.4 编码非光合系统基因突变14-15
• 1.3 转录组测序与功能基因挖掘15-16
• 1.3.1 转录组测序原理15
• 1.3.2 转录组测序数据分析15-16
• 1.3.3 转录组功能基因挖掘16
• 1.4 技术路线16-17
• 2 红苞凤梨DNA-AFLP分析17-26
• 2.1 实验材料17
• 2.2 实验仪器17
• 2.3 实验试剂17
• 2.4 实验方法17-23
• 2.4.1 红苞凤梨基因组DNA提取17-18
• 2.4.2 DNA质量检测18-19
• 2.4.3 AFLP体系的建立19-23
• 2.4.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳23
• 2.4.5 银染23
• 2.5 结果与分析23-26
• 2.5.1 基因组DNA质量检测23-24
• 2.5.2 AFLP预扩增结果24
• 2.5.3 选择性扩增结果24-26
• 3 红苞凤梨转录组分析26-38
• 3.1 实验材料26
• 3.2 实验仪器26
• 3.3 实验试剂26
• 3.4 实验方法26-29
• 3.4.1 红苞凤梨总RNA的提取26-27
• 3.4.2 总RNA琼脂糖凝胶电泳27
• 3.4.3 总RNA紫外分光光度计检测27
• 3.4.4 转绿组测序27
• 3.4.5 转录组测序信息分析27-29
• 3.5 结果与分析29-38
• 3.5.1 总RNA质量检测29
• 3.5.2 测序数据统计与评估29-38
• 4 红苞凤梨叶绿素合成前体物质含量分析38-41
• 4.1 实验材料38
• 4.2 测定项目与方法38-39
• 4.2.1 δ-氨基乙酰丙酸(ALA)含量测定38
• 4.2.2 胆色素原(PBG)含量测定38
• 4.2.3 尿卟啉原Ⅲ(Uroporphyrinogen Ⅲ)和粪卟啉原Ⅲ(CoprogenⅢ)含量测定38-39
• 4.2.4 原卟啉Ⅸ(Protoporphyrin Ⅸ)、镁原卟啉Ⅸ(Mg-ProtoⅨ)、原叶绿素酸脂(Pchlide)含量测定39
• 4.2.5 叶绿素含量测定39
• 4.3 结果与分析39-41
• 4.3.1 红苞凤梨叶片全绿部分与全白部分叶绿素合成前体物含量差异39-41
• 5 红苞凤梨内参基因的筛选41-51
• 5.1 实验材料41
• 5.2 实验仪器及试剂41
• 5.2.1 主要实验仪器41
• 5.2.2 实验试剂41
• 5.3 实验方法41-45
• 5.3.1 内参基因引物设计41-42
• 5.3.2 引物筛选42-45
• 5.4 结果与分析45-51
• 5.4.1 内参基因PCR扩增结果45-46
• 5.4.2 内参基因标准曲线制备结果46-49
• 5.4.3 内参基因在不同样品中的qRT-PCR结果49-50
• 5.4.4 内参基因表达稳定性分析50-51
• 6 红苞凤梨叶绿素合成相关基因REAL TIME QPCR表达分析51-60
• 6.1 实验材料、仪器与试剂51
• 6.2 实验方法51-53
• 6.2.1 目的基因引物设计51
• 6.2.2 PCR扩增与标准曲线的制备51-52
• 6.2.3 Real time qPCR52-53
• 6.3 结果与分析53-60
• 6.3.1 PCR扩增结果53
• 6.3.2 标准曲线制备结果53-59
• 6.3.3 Real time qPCR结果59
• 6.3.4 红苞凤梨自化细胞叶绿素合成受阻关键基因筛选59-60
• 7 讨论60-65
• 7.1 红苞凤梨绿、白组织基因组DNA差异分析60-61
• 7.2 转录组测序结果极大地丰富了红苞凤梨基因序列信息61-62
• 7.3 红苞凤梨白化细胞叶绿素合成受阻关键步骤62-63
• 7.4 红苞凤梨内参基因筛选63
• 7.5 叶绿素合成代谢基因表达模式分析及关键基因筛选63-64
• 7.6 实验方法改进64-65
• 7.6.1 DNA提取64
• 7.6.2 RNA提取64
• 7.6.3 UroⅢ提取64-65
• 8 结论65-66
• 参考文献66-70
• 致谢70-71
• 攻读学位期间发表的学术论文目录71

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