乳酸乳球菌异源表达漆酶及在玉米秸秆青贮应用
发布时间：2020-12-04 05:20
青贮是制备反刍动物饲料的重要方法,乳酸菌是青贮工艺的核心,是影响青贮饲料品质的决定因素。筛选区域适应性乳酸菌,定向、高效、安全地改造乳酸菌是当前青贮研究的重要方向。纤维素转化率低使得青贮饲料利用效率低,导致养殖成本增加。漆酶参与木质素降解,提高纤维素转化率。通过基因工程的方法构建能够分泌漆酶的乳酸菌,是提高饲料利用效率的有效手段。本文按照乳酸乳球菌NZ9000密码子偏好性,优化含有Usp45信号肽的枯草芽孢杆菌CotA漆酶基因序列（S-CotA）,在大肠杆菌中验证优化后CotA漆酶表达活性,并将S-CotA漆酶基因与pMG36e载体连接,电转入乳酸乳球菌NZ9000,构建出具有分泌漆酶能力的重组乳酸乳球菌。优化重组菌株培养条件,表征漆酶酶学性质,考察重组乳酸乳球菌对青贮玉米秸秆品质影响。主要结果如下:1.CotA漆酶基因与pET-30a（+）表达载体连接后转化入E.coli Transetta（DE3）中。SDS-PAGE和Western Blot分析结果表明CotA漆酶能够在大肠杆菌中表达。重组菌胞内漆酶活力最高达到443.5U/L。2.S-CotA漆酶基因与乳酸菌表达载体pMG36...
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
木质纤维素结构示意图
乳酸乳球菌异源表达漆酶及在玉米秸秆青贮应用V2代表在反应体系中，酶液的体积。ε代表以ABTS为底物时，其产物在420nm处摩尔吸光系数36mM-1cm-1。d代表吸光杯的内径或光程厚度(cm)。n代表稀释倍数。2.3实验结果2.3.1枯草芽孢杆菌CotA漆酶基因的PCR扩增以pUC57-Simple-S-CotA质粒DNA作为模板，PCR扩增CotA漆酶基因，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果如图2.2所示。扩增得到的单一条带大小约为1600bp，电泳结果与目的条带（1563bp）大小相符，说明CotA漆酶基因克隆成功。图2.2CotA漆酶基因PCR电泳图M：Trans2000DNAMarker；1：CotA漆酶基因PCR产物Figure2.2PCRelectrophoresisofCotAlaccasegeneM:Trans2000DNAMarker;1:PCRproductofCotAlaccasegene2.3.2重组克隆载体的构建及筛选鉴定2.3.2.1pEASY-Blunt-Simple-CotA重组质粒PCR鉴定将pEASY-Blunt-Simple-CotA重组质粒进行质粒PCR鉴定，鉴定结果如图2.3所示。扩增得到的单一条带大小约为1700bp，电泳结果与预期条带（1665bp）大小相符（泳道5，8，10除外），初步证明重组克隆载体构建成功。2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM119
内蒙古大学图2.3pEASY-Blunt-Simple-CotA质粒PCR鉴定电泳图M：Trans2000DNAMarker；1-4，6-7，9：阳性克隆PCR产物；5，8，10：阴性克隆PCR产物Figure2.3PlasmidPCRIdentificationElectrophoresisofpEASY-Blunt-Simple-CotAM:Trans2000DNAMarker;1-4,6-7,9:PCRproductsofpositiveclones;5,8,10:PCRproductsofnegativeclones2.3.2.2pEASY-Blunt-Simple-CotA重组质粒单、双酶切鉴定挑选PCR结果正确的重组质粒进一步进行单、双酶切鉴定，鉴定结果如图2.4所示。单酶切获得的条带大于5000bp，双酶切获得了大小约为3800bp和1500bp的两个条带，单、双酶切鉴定结果与预期结果相符（重组质粒与目的基因大小分别为5394bp和1549bp），证明重组质粒构建成功。测序结果也表明目的序列没有碱基突变（附录10），可以进行下一步实验。图2.4pEASY-Blunt-Simple-CotA单、双酶切产物验证电泳图M：Trans5000DNAMarker；1-2：单酶切产物；3：双酶切产物Figure2.4VerifyelectropherogramofsingleanddoubledigestedproductsofpEASY-Blunt-Simple-CotAM:Trans5000DNAMarker;1-2:singledigestedproduct;3:doubledigestedproduct2.3.3重组表达载体的构建及筛选鉴定2.3.3.1pET-30a(+)及pEASY-Blunt-Simple-CotA的双酶切根据pET-30a(+)及pEASY-Blunt-Simple-CotA上含有的NcoI及HindIII酶切位点，用2000bp1000bp500bp250bp100bp5000bp3000bp1500bp1000bp500bp300bpMM1234567891012320
本文编号：2897073
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
木质纤维素结构示意图
乳酸乳球菌异源表达漆酶及在玉米秸秆青贮应用V2代表在反应体系中，酶液的体积。ε代表以ABTS为底物时，其产物在420nm处摩尔吸光系数36mM-1cm-1。d代表吸光杯的内径或光程厚度(cm)。n代表稀释倍数。2.3实验结果2.3.1枯草芽孢杆菌CotA漆酶基因的PCR扩增以pUC57-Simple-S-CotA质粒DNA作为模板，PCR扩增CotA漆酶基因，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果如图2.2所示。扩增得到的单一条带大小约为1600bp，电泳结果与目的条带（1563bp）大小相符，说明CotA漆酶基因克隆成功。图2.2CotA漆酶基因PCR电泳图M：Trans2000DNAMarker；1：CotA漆酶基因PCR产物Figure2.2PCRelectrophoresisofCotAlaccasegeneM:Trans2000DNAMarker;1:PCRproductofCotAlaccasegene2.3.2重组克隆载体的构建及筛选鉴定2.3.2.1pEASY-Blunt-Simple-CotA重组质粒PCR鉴定将pEASY-Blunt-Simple-CotA重组质粒进行质粒PCR鉴定，鉴定结果如图2.3所示。扩增得到的单一条带大小约为1700bp，电泳结果与预期条带（1665bp）大小相符（泳道5，8，10除外），初步证明重组克隆载体构建成功。2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM119
内蒙古大学图2.3pEASY-Blunt-Simple-CotA质粒PCR鉴定电泳图M：Trans2000DNAMarker；1-4，6-7，9：阳性克隆PCR产物；5，8，10：阴性克隆PCR产物Figure2.3PlasmidPCRIdentificationElectrophoresisofpEASY-Blunt-Simple-CotAM:Trans2000DNAMarker;1-4,6-7,9:PCRproductsofpositiveclones;5,8,10:PCRproductsofnegativeclones2.3.2.2pEASY-Blunt-Simple-CotA重组质粒单、双酶切鉴定挑选PCR结果正确的重组质粒进一步进行单、双酶切鉴定，鉴定结果如图2.4所示。单酶切获得的条带大于5000bp，双酶切获得了大小约为3800bp和1500bp的两个条带，单、双酶切鉴定结果与预期结果相符（重组质粒与目的基因大小分别为5394bp和1549bp），证明重组质粒构建成功。测序结果也表明目的序列没有碱基突变（附录10），可以进行下一步实验。图2.4pEASY-Blunt-Simple-CotA单、双酶切产物验证电泳图M：Trans5000DNAMarker；1-2：单酶切产物；3：双酶切产物Figure2.4VerifyelectropherogramofsingleanddoubledigestedproductsofpEASY-Blunt-Simple-CotAM:Trans5000DNAMarker;1-2:singledigestedproduct;3:doubledigestedproduct2.3.3重组表达载体的构建及筛选鉴定2.3.3.1pET-30a(+)及pEASY-Blunt-Simple-CotA的双酶切根据pET-30a(+)及pEASY-Blunt-Simple-CotA上含有的NcoI及HindIII酶切位点，用2000bp1000bp500bp250bp100bp5000bp3000bp1500bp1000bp500bp300bpMM1234567891012320
本文编号：2897073
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