人BAFF基因的克隆、表达及抗体制备
发布时间：2021-03-20 20:54
B淋巴细胞刺激因子(B cell activating factor belonging to the TNF family，BAFF)是1999年新发现的一个细胞因子，属于肿瘤坏死因子超家族成员。人BAFF(hBAFF)属Ⅱ型跨膜糖蛋白，全长285个氨基酸，主要表达于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞表面。BAFF有三种受体：TACI、BCMA和BAFF-R。Moore等人研究发现，BAFF受体仅表达于B细胞和B细胞起源的细胞系上。 实验表明，BAFF与B淋巴细胞的活化、增殖、抗体产生、免疫球蛋白类别转换等有关。现已发现，BAFF信号异常可能与多种自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征等相关，也与肿瘤如多发性骨髓瘤、慢性B淋巴细胞性白血病等相关。对hBAFF的深入研究将会成为研究人类自身免疫性疾病以及B细胞系肿瘤发病机理的新热点，而阻断BAFF发挥生物学作用的单克隆抗体具有潜在的临床应用价值。 本研究利用RT-PCR的方法从人外周血单个核细胞扩增得到BAFF胞外区83—285氨基酸(hsBAFF_(83-285))的编码基因，与原核表达载体pET-30a(+)进行连接，在BL21(DE3)中重组蛋白得到了大量表达，主要以包涵体形式存在于沉淀中。我们将纯化的重组蛋白免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术，用甲基纤维素半固体培养基培养杂交瘤细胞，制备了单克隆抗体。通过免疫双向扩散、间接ELISA、Western blot和流式细胞技术鉴定了抗体的特性。同时，我们从人外周血单个核细胞cDNA中扩增得到可溶形式BAFF(hsBAFF)的编码基因，将其克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中。优化各种诱导表达条件后，得到了重组蛋白的可溶形式表达。通过扩大培养，利用GST亲和柱纯化裂解上清中可溶形式蛋白，并将纯化后蛋白免疫新西兰兔制备了抗hsBAFF的兔多抗血清。ELISA、Western blot鉴定了该多抗血清能与GST-hsBAFF重组蛋白发生特异性反应。 本研究所制备的抗hBAFF单克隆抗体和多克隆抗体可以为BAFF的基础与临床研究提供有力的工具，为深入研究BAFF与人类自身免疫性疾病和B细胞系肿瘤的关系，探讨针对BAFF的自身免疫性疾病的检测新方法和治疗新途径奠定了基础。
本文编号：1567125
【学位授予单位】：北京协和医学院北京市211工程院校985工程院校
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【页数】：72 页
文章目录
中文摘要
ABSTRACT
英文缩略语
前言
材料和方法
1.实验材料
1.1 主要化学试剂及抗体
1.2 主要工具酶、分子量标准和试剂盒
1.3 引物
1.4 菌株及质粒载体
1.5 细胞株
1.6 仪器设备
1.7 实验动物
1.8 溶液配制
2.方法
2.1 hBAFF83-285基因的克隆和表达载体的构建
2.2 hBAFF83-285-His蛋白的原核表达及纯化
2.3 hsBAFF基因的克隆、原核表达及纯化
2.4 pGEX-4T-1/hsBAFF表达载体的构建
2.5 GST-hsBAFF蛋白的原核表达及纯化
2.6 蛋白质浓度测定
2.7 抗hBAFF83-285单克隆抗体的制备
2.8 抗hBAFF83-285单克隆抗体特异性鉴定
2.9 单克隆抗体的亚类鉴定及纯化
2.10 辣根过氧化物酶标记抗体
2.11 ELISA检测HRP标记抗体的合适稀释度
2.12 抗hsBAFF蛋白单克隆抗体之间配对实验和可配对抗体灵敏度检测
2.13 抗GST-hsBAFF多克隆抗体的制备
2.14 兔多抗血清的鉴定
结果
1.pET-30a（+）/hBAFF83-285重组质粒的构建及鉴定
2.hBAFF83-285基因的原核表达及纯化
3.hsBAFF基因的克隆、原核表达及纯化
4.重组蛋白浓度测定
5.重组hBAFF83-285-His蛋白免疫小鼠效果检测
6.抗hsBAFF单克隆抗体特异性鉴定
7.抗hsBAFF单克隆抗体的亚类鉴定及纯化
8.HRP标记单克隆抗体结果检测
9.抗hsBAFF单抗初步建立检测hsBAFF的双抗体夹心ELISA方法
10.pGEX-4T-1/hsBAFF表达载体的构建
11.GST-hsBAFF蛋白的原核表达
12.GST-hsBAFF蛋白的纯化
13.GST融合蛋白定量及免疫新西兰兔免疫效果检测
14.兔多抗血清的鉴定
讨论
小结
参考文献
综述
附录
致谢
参考文献
期刊论文
[1]外周血CD4+CD25+T细胞表达在系统性红斑狼疮患者中的意义[J]. 杨旭燕,鲁晓勇,许东航,吕庆华,王巧宏,吴华香. 中华内科杂志. 2005(08)
[2]系统性红斑狼疮患者血清B细胞激活因子水平的检测[J]. 周琳,屠小卿,朱烨,陆慧琦,许臻,范列英,侯晓菁,孔宪涛,仲人前. 中华风湿病学杂志. 2005(04)
[3]系统性红斑狼疮患者T细胞上Fas受体分子与疾病活动指数的相关性研究[J]. 李富荣,肖学吕,叶志中,齐辉,任莉莉,张丽君,王新根. 中华风湿病学杂志. 2005(04)
[4]TFAR19蛋白在系统性红斑狼疮患者血清中水平的检测[J]. 宋清华,陈英玉,狄春晖,陈学荣,李世荫. 中华风湿病学杂志. 2003(09)
本文编号：1567125
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