羊口疮病毒重庆株的分离鉴定及其F1L基因原核表达研究

发布时间：2018-10-15 08:44

【摘要】：羊口疮病毒(Orf virus,OrfV)属于痘病毒科、副痘病毒属成员,为有囊膜线性双股DNA病毒,是引起绵羊、山羊发生以口唇、舌、鼻、乳房等部位皮肤、黏膜形成丘疹、脓疱、溃疡以及结成疣状厚痂为主要特征的接触性、嗜上皮性、人兽共患传染病病原。国内外的研究已证明该病毒是一种变异性较强的病毒,各地分离的病毒在致病性上存在着较大差异,基因组限制性酶切图谱分析表明也存在差异。2013年10月重庆市江津县某羊场羊只出现疑似羊口疮疫情。为了获得地方流行毒株,分析主要抗原基因F1L基因的分子变异特点以及为羊口疮防控的研究奠定基础,本实验开展了以下研究:1.羊口疮病毒重庆株(OrfV-CQ株)的分离鉴定:采集病羊口唇部痂皮,提取核酸,PCR鉴定为羊口疮病毒阳性,以阳性病料接种MDBK细胞分离病毒,通过透射电镜、间接免疫荧光、PCR方法扩增、序列测定及同源性分析和动物感染试验鉴定病毒。结果:阳性病料接种MDBK细胞后,F1至F3代并无明显CPE现象,F4代MDBK细胞于48 h开始变圆、聚集、融合、拉网甚至脱落;透射电镜观察感染细胞的胞浆中有大量成熟与未成熟的病毒粒子;在接毒MDBK细胞浆中观察到了亮绿色的免疫荧光;提取F3~F13代接毒细胞悬液DNA,PCR方法均能扩增出特异性目的片段(708 bp),该序列与GenBank中38株OrfV-F1L基因核苷酸的同源性为97%~99%;测定F6代细胞毒TCID50值为10-4.25/0.1 mL;细胞培养物人工接种宿主动物山羊,能复制出与羊口疮相似的临床症状。2.羊口疮病毒重庆株(OrfV-CQ株)F1L基因的生物信息学分析:根据GenBank上收录OrfV基因序列(No.AY040083),应用Premier Primer 5.0软件设计针对OrfV-F1L基因全长引物,对OrfV-CQ株F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学相关软件(DNAStar,SignalP 4.1等)分析序列同源性,绘制遗传进化树,预测二级结构及B细胞抗原表位和信号肽。结果显示:F1L基因PCR扩增产物大小为1023 bp,编码340个氨基酸;与Genbank收录20株相应序列核苷酸同源性为93.9%~98.4%,氨基酸的同源性仅与shanxi株(登录号HQ221964)同源,为95.0%,与其余序列氨基酸同源性为12.2%~13.1%;二级结构以α螺旋和β折叠较少,β转角和无规则卷曲较多,预测此蛋白可能存在13个B细胞优势抗原表位,无信号肽区域。3.羊口疮病毒重庆株(OrfV-CQ株)F1L基因的原核表达研究:提取OrfV-CQ株病毒核酸为模板,扩增F1L基因,并将其克隆至pET-32a载体中,构建原核表达载体pET-32a-F1L,转化至大肠埃希菌BL21,优化表达条件,SDS-PAGE及Western bloting检测目的蛋白表达情况及其反应原性。结果:PCR扩增出F1L基因全长1023 bp,pET32-F1L在BL21工程菌中最佳表达时间为5 h,IPTG诱导浓度为0.2 mmol/L,融合蛋白大小为57.4 kDa,表达S-Tag融合蛋白与Anti-S antibody发生了特异性反应。结论:从发病山羊分离到1株羊口疮病毒,命名为Orf V-CQ株;Orf V-CQ株F1L基因生物信息学分析表明,F1L基因核苷酸序列比较保守,但存在碱基缺失和突变,F1L蛋白具有众多的B细胞优势抗原表位;构建了OrfV F1L基因原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

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本文编号：2271992