猪圆环病毒2型病毒样颗粒性疫苗的制备与免疫评价

发布时间：2019-11-06 19:41

【摘要】：猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus 2,PCV2)与断奶仔猪多系统衰竭综(Postweaning mμLtisystemic wasting syndrome,PMWS)的发生密切相关,是其主要原发病原。PCV2还与猪皮炎肾病综合征、猪A2型先天性震颤、猪呼吸道病综合征等传染性疾病的发生相关。PMWS主要流行于5~18周龄的断奶仔猪,致死率较高,其临床症状主要呈现为:仔猪生长速率降低、体重减轻、呼吸急迫、皮炎、黄疸、淋巴结病变肿大等。PCV2在世界范围内的感染与流行,给养猪业造成了巨大的危害与经济损失。目前对PCV2的防控主要依靠疫苗,国内外也先后注册了全病毒灭活苗、重组嵌合苗和亚单位疫苗,在预防PCV2感染中发挥了重要作用。由于进口疫苗价格昂贵,而国产灭活疫苗效果仍不够理想,因而研制高效、廉价、安全的新型PCV2亚单位疫苗的需要已日益迫切。基于PCV2结构蛋白(Capsid)能在体外自组装成病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)的特性,我们采用大肠杆菌高密度发酵的方法对重组的Cap蛋白进行了可溶性表达,并纯化制备成病毒样颗粒,为新型PCV2 VLPs亚单位疫苗的研制奠定了基础,本研究主要分为以下几个部分:(1)将含有pET28a-ORF2质粒的大肠杆菌菌株BL21DE3,进行了高密度发酵试验,并对发酵条件进行了摸索,建立了比较稳定的10 L发酵罐体系,收获湿菌体量达93.9±1.9g/L;且得到的重组Cap蛋白以可溶形式存在,为重组Cap蛋白的纯化及PCV2疫苗的研制奠定了基础。(2)将高密度发酵所得菌体进行高压均质破碎。所得上清用硫酸铵沉淀法进行初步除杂,然后采用IEC SP FF阳离子交换层析柱进行纯化,并对相应条件进行了摸索,得到相对纯度达85%以上的Cap蛋白,并对Cap蛋白体外组装病毒样颗粒(VLPs)条件进行了摸索,成功制备了与PCV2天然病毒结构相似的VLPs。(3)建立评价PCV2 Cap蛋白体外稳定性的双抗夹心ELISA检测,使用该方法检测了不同贮存温度、不同反复冻融次数、不同保护剂等条件下Cap蛋白的活性变化。结果显示,Cap蛋白在25°C以下贮存时,其活性保持稳定;贮存时不同温度间变换对蛋白稳定性影响较大;在甘氨酸和甘油2种蛋白保护剂存在条件下蛋白活性的稳定性增强。(4)利用高纯度Cap蛋白组装的VLPs作为抗原,分别免疫Balb/c小鼠和仔猪;通过检测抗体效价及动物的生产性能对疫苗免疫进行评价。小鼠免疫评价实验中,VLPs抗原分别与50V矿物油、IMS1313及卡波姆等佐剂按一定比例混合,制备PCV2重组VLPs疫苗;分别将生理盐水、勃林格猪圆环病毒2型疫苗分别设为阴性和阳性对照,对接种后12周内抗体效价进行检测与分析。结果显示,同种剂量情况下,油佐剂免疫效果与阳性对照组相当,抗体效价于第2周开始持续上升,并长期维持在较高水平,而水性佐剂表现较差。进行两次仔猪临床生产性能评价,每次选取150头仔猪,分为50V油佐剂疫苗注射组、生理盐水组、勃林格疫苗组,分别在15日龄注射1mL,记录生产性能。其中第一批免疫生理盐水组增重率高于勃林格疫苗组和50V油佐剂疫苗组,分别为200%、189%、180%,疫苗免疫效果不理想;而在第二批免疫中勃林格疫苗组和50V油佐剂疫苗组增重率高于生理盐水组,分别为296%、304%、252%;表明配制的重组VLPs油佐剂亚单位疫苗有相对较好的免疫效果。本研究的意义在于成功建立了能够可溶表达PCV2重组Cap蛋白的大肠杆菌高密度发酵体系;纯化制备纯度较高的Cap蛋白,并对其进行了外稳定性进行了探索,且成功制备出了PCV2的VLPs;将所得VLPs与各类佐剂配合制成了不同的亚单位疫苗,并对其免疫效果进行了评价分析,最终确定50V油佐剂疫苗具有良好的免疫效果,为PCV2亚单位疫苗的开发奠定了基础。
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.28

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