TCDCA与TGR5相互作用的研究

发布时间：2021-10-13 01:26

　　TCDCA作为胆汁酸的主要成分,已被证实可介导多种信号通路,从而发挥其抗炎免疫调节的作用。本研究旨在深入探讨TCDCA能否与TGR5受体发生相互作用,继而参与由TGR5受体介导的信号转导通路。本研究构建了TGR5真核表达载体,并在293T细胞中进行了表达,在此基础上,采用免疫荧光、实时荧光定量PCR技术、western blotting技术,鉴定了TGR5受体在293T细胞中的表达。采用荧光显微镜观测法,检测了293T细胞受体内陷;采用ELISA法,测定了293T细胞内cAMP含量,分析了TCDCA的量效关系,293T细胞中荧光素酶报告基因活性。结果显示,TGR5真核表达载体构建成功,并能够在239T中表达。TCDCA作用TGR5后,可引起转染TGR5受体的293T细胞内陷反应,细胞内cAMP和萤光素酶含量显著升高（P<0.01）,且呈现剂量依赖性关系（r2=0.9958）。结论:TCDCA能够与TGR5发生相互结合。 

【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 胆汁酸概况
        1.1.1 胆汁酸来源及分类
        1.1.2 胆汁酸生理作用
        1.1.3 胆汁酸受体研究进展
        1.1.4 TGR5受体研究概况
    1.2 TCDCA研究概况
        1.2.1 TCDCA的理化性质
        1.2.2 TCDCA作用的研究概况
    1.3 真核表达系统和 293T细胞
    1.4 本研究的目的和意义
2 实验材料
    2.1 细胞、组织
    2.2 实验试剂、药品
    2.3 试验仪器
3 数据处理和统计学分析
4 试验方法
    4.1 TGR5真核表达载体的构建
        4.1.1 引物设计与合成
        4.1.2 PCMV-EGFP-TGR5真核表达载体构建
        4.1.3 pCMV-TGR5载体构建构建
    4.2 TGR5受体在细胞中的表达及其测定
        4.2.1 293T细胞的培养
        4.2.2 TGR5在 293T细胞中的瞬时转染
        4.2.3 TGR5在 293T细胞中转染效果的测定
        4.2.4 TGR5受体表达定位
        4.2.5 293T细胞中TGR5基因mRNA表达量测定
        4.2.6 293T细胞中TGR5蛋白表达
    4.3 TCDCA与TGR5的结合活性的研究
        4.3.1 TCDCA的量效关系分析
        4.3.2 TGR5受体内陷
        4.3.3 TCDCA对细胞内cAMP含量的影响
        4.3.4 TCDCA对细胞内荧光素酶报告基因含量的影响
5 结果与讨论
    5.1 含TGR5目的片段真核表达载体的构建
        5.1.1 人TGR5基因扩增
        5.1.2 重组质粒pMD19-T-TGR5鉴定
        5.1.3 真核表达载体pCMV-EGFP-TGR5的鉴定
        5.1.4 pCMV-TGR5质粒鉴定
    5.2 TGR5受体在细胞中的表达及其测定
        5.2.1 TGR5在 293T细胞中转染效果的测定
        5.2.2 TGR5受体定位
        5.2.3 293T细胞细胞中TGR5基因mRNA表达量测定
        5.2.4 293T细胞中TGR5蛋白表达
    5.3 TCDCA与TGR5的结合活性的研究
        5.3.1 TCDCA的量效关系分析
        5.3.2 293T细胞内陷的测定
        5.3.3 细胞内cAMP含量测定
        5.3.4 荧光素酶报告基因含量测定
6 全文讨论
    6.1 真核表达载体构建
    6.2 TCDCA与TGR5相互作用
        6.2.1 受体内陷的研究
        6.2.2 TCDCA作用于TGR5后的量效关系分析
        6.2.3 TCDCA与TGR5结合后的继发反应
    6.3 TGR5介导的信号通路研究
7 全文结论
8 课题创新之处
致谢
参考文献
作者简介



本文编号：3433690