PEDV毒株的分离鉴定及抗体ELISA检测方法的建立

发布时间：2025-06-26 23:47

　　猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种急性、高致病性肠道传染病,主要危害哺乳仔猪。临床表现为水样腹泻,呕吐脱水等症状。哺乳仔猪通过乳汁中的母源抗体(分泌性IgA)获得被动免疫保护是较为有效的预防方式,检测乳汁中的抗体对于防控PED具有重要意义。本研究从临床检测病料中分离到一株PEDV并进行鉴定;在HEK-293悬浮细胞中表达了该毒株的N蛋白,以其为抗原分别建立了检测PEDV血清IgG及乳汁IgA抗体的间接ELISA检测方法,为PEDV的预防提供支持。相关研究结果如下:1.PEDV-JX18毒株的分离与鉴定2018年江西省某猪场送检疑似感染PEDV的小肠组织,剪碎研磨并用细胞培养基过夜浸泡研磨组织获得病毒液,通过Vero细胞进行病毒分离,在Vero细胞上盲传至第五代时观察到细胞病变,经RT-PCR,IFA,透射电镜及细胞超薄切片等方法鉴定,确定分离出一株田间的猪流行性腹泻病毒,并命名为PEDV-JX18株。2.PEDV血清IgG间接ELISA方法的建...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图2.1 PEDV细胞病变观察

当接种疑似感染组织浸出液的细胞盲传至第五代时,观察到细胞病变(图2.1),对照细胞呈现为典型的“铺路石样”,而对照细胞则明显出现细胞病变,表现为细胞融合皱缩,成片脱落留下大片的空隙区。2.3.2RT-PCR检测结果

图2.2 RT-PCR扩增N基因的琼脂糖凝胶电泳结果

提取细胞培养物总RNA并进行反转录,进行RT-PCR检测,PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,扩增得到大小约为701bp的目标条带(图2.2)。结果显示,与对照细胞产物相比出现特异性条带,该特异性条带经基因序列测定证明分离的病毒为猪流行性腹泻病毒,并将其命名为PEDV-JX....

图2.3间接免疫荧光试验检测Vero细胞内的PEDV

Vero细胞接毒30h时细胞病变较为明显,用4.0%多聚甲醛固定15min,0.5%TritonX-100(PBS配制)室温透化20min,按比例加入特异性PEDVN蛋白单克隆抗体进行IFA。实验组与对照细胞相比,感染PEDV的Vero细胞上可观察到特异性的红色荧光,说....

图2.4 PEDV透射电镜图

收取接毒后细胞培养的培养基并进行超速离心,30,000rpm/min,PBS重悬沉淀。经过磷钨酸钠溶液负染后,透射电镜下可观察到形态完整的病毒粒子,其中心是电子不透明区,周围由囊膜包裹,囊膜上可看到短小的纤突。(图2.4)。2.3.5细胞超薄切片检测结果

本文编号：4053462