炎症微环境下葡萄糖对钛片周围巨噬细胞极化的调控作用

发布时间：2020-09-23 09:17

　　 背景种植修复不仅可以减少对天然牙的损伤,最大限度的恢复患者的咀嚼功能,还可以延缓牙槽骨的吸收,明显改善患者的生活质量,现已成为当前修复缺失牙的常规治疗方案之一。种植体周围炎作为种植术后常见的并发症之一,其与牙周炎的致病菌相似。牙龈卟啉单胞菌作为种植体周围炎的主要致病菌,可产生多种毒力因子,同时引起种植体周围软、硬组织的炎症破坏。巨噬细胞作为固有免疫的重要组成部分,是执行固有免疫的效应细胞,并广泛分布于组织中。Pg所分泌的多种毒力因子如脂多糖及牙龈蛋白酶等与巨噬细胞的极化密切相关。极化的巨噬细胞在组织炎症破坏及修复过程中发挥重要的作用。随着物质生活水平的不断提高及人口老龄化,我国糖尿病患者的数量正在急速增加。在口腔局部微环境下,糖尿病患者种植手术术后常出现伤口愈合缓慢、易发生感染的情况,导致种植体周围炎,影响种植手术的成功率。本研究在体外模拟高血糖伴有炎症微环境条件,将钛片与巨噬细胞共培养,探究血糖对巨噬细胞极化的影响,以了解巨噬细胞在此过程中的作用,有助于理解糖尿病患者种植体周围炎的发病机制,为其防治提供新思路。方法:1.细胞培养选取小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞,用H-DMEM培养基进行复苏、培养,传代,备用。2.钛片预处理用600目和1000目砂纸逐级打磨钛片,去离子水清洗,5%硝酸钝化20min,在丙酮溶液中超声荡洗30min,70%乙醇浸泡10min,去离子水浸泡10min,高压灭菌,备用。3.实验分组实验根据细胞培养液中葡萄糖浓度的不同分为2组,即5.5m M葡萄糖组+19.5m M甘露醇(正常糖组)和25m M葡萄糖组(高糖组)。4.ELISA法检测巨噬细胞极化相关因子蛋白质的表达取上述备用细胞接种到6孔板中,每孔加1mg/m L Pg-LPS 20μL及上述2组含不同葡萄糖浓度的细胞培养液2m L,与钛片共培养24小时后,采用ELISA法检测巨噬细胞极化相关因子蛋白质的表达情况。5.q RT-PCR法检测巨噬细胞极化相关因子基因的表达细胞培养方法同上,采用q RT-PCR法检测巨噬细胞极化相关因子基因的表达情况。结果:1.ELISA检测结果在不同葡萄糖浓度条件下,Pg-LPS刺激RAW264.7细胞与钛片进行共培养24小时。与正常糖组比较,高糖组IL-6,i NOS和TNF-α蛋白质质的表达升高(P0.05),IL-10和Arg-1蛋白质的表达降低(P0.05)。2.q RT-PCR检测结果在不同葡萄糖浓度条件下,Pg-LPS刺激RAW264.7细胞与钛片进行共培养24小时。与正常糖组比较,高糖组IL-6,IL-10,Arg-1,i NOS和TNF-α基因的表达均与蛋白质的表达结果一致,即IL-6,i NOS和TNF-α基因的表达均升高(P0.05),而IL-10和Arg-1基因的表达降低(P0.05)。结论:1.在体外高糖条件下,RAW264.7细胞在Pg-LPS刺激下与钛片共培养,炎症因子TNF-α和IL-6表达升高;2.在体外高糖炎症微环境下,高糖能诱导与钛片共培养的巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R783.6
【部分图文】：

25mM 葡萄糖图 2.1 RAW264.7 细胞的形态(A：×40；B：×100)2.3.2 ELISA检测RAW264.7细胞内IL-6, IL-10, iNOS, Arg-1和TNF-α蛋白质的表达RAW264.7 细胞在 10 μg/mL Pg-LPS 刺激下与钛片共培养，在不同糖浓度的培养基中培养 24h 后，ELISA 结果显示：25mM 葡萄糖组与5.5mM 葡萄糖+19.5mM 甘露醇组相比，IL-6, iNOS 和 TNF-α蛋白质表达升高(P＜0.05)，IL-10 和 Arg-1 蛋白质表达降低(P＜0.05)(图 2.2)。

图 2.2 RAW264.7 IL-6, IL-10, iNOS, Arg-1 和 TNF-α蛋白质的表达注:GLU:葡萄糖; MAN:甘露醇2.3.3 qRT-PCR 检测 RAW264.7 细胞内 IL-6, IL-10, iNOS, Arg-1 和 TNF-α的基因表达RAW264.7 细胞在 10 μg/mL Pg-LPS 刺激下与钛片共培养，在不同葡萄糖浓度的培养基中培养 24h 后，实时定量 PCR(Quantitativereal-time PCR, qRT-PCR)结果显示：高糖葡萄糖组与 5.5mM 葡萄糖+19.5mM 甘露醇组相比，IL-6, IL-10, iNOS, Arg-1 和 TNF-α基因表达与蛋白质表达结果一致，即 IL-6, iNOS 和 TNF-α基因的表达均升高(P＜0.05)，而 IL-10 和 Arg-1 基因的表达下降(P＜0.05)(图 2.3)。

图 2.3 RAW264.7 细胞 IL-6, IL-10, iNOS, Arg-1 和 TNF-α mRNA 的表达注:GLU:葡萄糖; MAN:甘露醇

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