灵芝中性三萜组分的制备、质量控制及抗肿瘤活性的研究

发布时间：2018-12-15 21:22

【摘要】：目的优化灵芝中性三萜组分的提取纯化工艺,建立灵芝中性三萜组分的质量控制方法,通过体内、外实验,评价灵芝中性三萜组分的抗肿瘤活性,并对其安全性进行初步研究,为灵芝三萜抗肿瘤新药的研发奠定基础。方法1.灵芝中性三萜组分的提取纯化(1)通过单因素和正交试验,优化灵芝总三萜的提取工艺。(2)应用AB-8型大孔吸附树脂,对灵芝中性三萜组分进行富集纯化。2.灵芝中性三萜组分质量控制的初步研究(1)采用紫外-可见分光光度法(UV-vis)建立灵芝中性三萜组分中总三萜的含量测定方法。(2)运用反相高效液相色谱(RP-HPLC)技术,初步建立灵芝中性三萜组分的HPLC指纹图谱。3.灵芝中性三萜组分体内外抗肿瘤活性的研究(1)采用MTT法体外检测两种不同方法(溶剂法和树脂法)制备的灵芝中性三萜组分对人慢性粒细胞白血病细胞株K562、人髓系-白血病细胞株HL60生长的抑制作用。(2)采用溶剂--熔融法,建立灵芝中性三萜固体分散体的制备方法。(3)分别建立小鼠H22和S180实体瘤以及腹水瘤的模型,观察灵芝中性三萜组分对这两种瘤株的抑瘤率(实体瘤)和生命延长率(腹水瘤)的影响,评价灵芝中性三萜组分体内抗肿瘤活性。4.灵芝中性三萜组分的一般药理学研究分别通过旷野法、金属棒法和倾斜板法,观察灵芝中性三萜固体分散体对小鼠自发活动及机能协调功能的影响;根据入睡率和睡眠时间来判断灵芝中性三萜固体分散体与戊巴比妥钠联用对小鼠的睡眠等神经系统方面的影响;使用生理机能记录仪记录给药前后灵芝中性三萜固体分散体对麻醉大鼠的呼吸频率、血压、心率等呼吸、心血管系统方面的影响。结果1.灵芝中性三萜组分的提取纯化(1)通过正交试验筛选及考虑生产成本等因素,选定回流提取法最优条件为:6倍量95%乙醇提取3次,每次1.5 h。(2)使用AB-8型大孔吸附树脂对灵芝中性三萜组分进行富集纯化,以1 BV/h的流速上样,树脂径高比为1:10,按照上样液体积与树脂体积比为4:1进行动态吸附(上样液1 ml相当于原生药0.35 g),水洗至无色后,依次用4倍树脂柱体积的饱和Na HCO3水溶液、水、60%和95%乙醇洗脱,洗脱流速为2BV/h,收集95%乙醇洗脱液,浓缩真空干燥即得。2.灵芝中性三萜组分质量控制的初步研究(1)采用UV-vis,建立了灵芝中性三萜组分中总三萜的含量测定方法。(2)灵芝中性三萜组分的指纹图谱中可标定11个特征明显的共有峰,指纹图谱分离效果理想。3.灵芝中性三萜组分体内外抗肿瘤活性的研究(1)两种不同方法制备的灵芝中性三萜对K562和HL60细胞的增殖均有抑制作用,树脂法和溶剂法灵芝中性三萜作用于K562细胞48 h的IC50值分别是120.36μg/ml和149.36μg/ml,作用于HL60细胞48 h的IC50值分别是30.63μg/ml和24.49μg/ml。(2)采用溶剂-熔融法,以F68和44/14为载体(1:1),按药物与载体的比例为1:8制备灵芝中性三萜组分的固体分散体,从而改善三萜组分的水溶性。(3)灵芝中性三萜固体分散体的三个实验组均有显著抑制H22和S180实体瘤生长的作用(P0.05),500 mg/kg组的抑瘤率分别为55.73%和53.58%;溶剂法制备的灵芝中性三萜固体分散体亦能显著抑制H22、S180实体瘤的生长(P0.05),但其500 mg/kg剂量的抑瘤率分别为21.22%和31.61%;非制备成固体分散体的灵芝中性三萜CMC-Na混悬液对H22、S180实体瘤的生长也有显著的抑制作用(P0.01),其500 mg/kg剂量的抑瘤率分别为28.28%和23.31%;灵芝中性三萜固体分散体的三个实验组均能延长H22、S180腹水瘤小鼠的存活时间,且以中、高剂量组的生命延长率较为显著(P0.05),500mg/kg组的生命延长率分别为35.4%和43.4%;溶剂法灵芝中性三萜固体分散体亦能显著延长H22、S180腹水瘤小鼠的生存时间(P0.05),500 mg/kg组的生命延长率分别为27.1%和32.8%;中性三萜CMC-Na混悬组能延长H22腹水瘤小鼠的生存时间,但对S180腹水瘤小鼠的生存时间的延长作用更为显著(P0.05),500mg/kg组的生命延长率分别为15.1%和20.5%。4.灵芝中性三萜组分的一般药理学研究灵芝中性三萜固体分散体(250~1000 mg/kg)对小鼠的自主活动、机能协调功能、戊巴比妥钠阈下催眠剂量及戊巴比妥钠睡眠时间均没有明显的影响;对麻醉大鼠的呼吸和心血管系统无影响(125~500 mg/kg)。结论1.灵芝中性三萜组分的提取纯化(1)经优化的提取方法,稳定可行,可用于灵芝总三萜的提取。(2)AB-8型大孔树脂吸附洗脱法具有选择吸附性强,富集效果理想,解吸条件较温和等优点,可用于灵芝中性三萜组分的富集纯化。2.灵芝中性三萜组分质量控制的初步研究(1)采用紫外-可见分光光度法建立的灵芝中性三萜组分的含量测定方法,该方法经典稳定,可作为灵芝中性三萜组分质量控制中的定量控制方法。(2)采用RP-HPLC法建立的灵芝中性三萜组分的指纹图谱,该方法可操作性强、重复性好,可用于灵芝中性三萜组分的定性质量控制。3.灵芝中性三萜组分体内外抗肿瘤活性的研究(1)两种灵芝中性三萜对K562和HL60细胞均有抑制增殖作用,表现出明显的量效关系,且这两种不同方法制备的灵芝中性三萜在体外对肿瘤细胞的抑制作用差别不大。(2)以F68和44/14为载体,采用溶剂-熔融法制备固体分散体,能提高灵芝三萜的分散性,改善灵芝三萜的水溶性,有望提高灵芝中性三萜组分的生物利用度。(3)灵芝中性三萜固体分散体对H22和S180这两种小鼠的瘤细胞不论是实体瘤还是腹水瘤,都有较强的活性;将灵芝中性三萜组分制备成固体分散体后抗肿瘤活性增加,提高了生物利用度;树脂法灵芝中性三萜的体内活性高于相同剂量的溶剂法灵芝中性三萜的体内活性,这也验证了大孔树脂吸附法用于灵芝中性三萜组分富集和纯化的可行性和优越性。4.灵芝中性三萜组分的一般药理学研究灵芝中性三萜固体分散体对动物的神经系统、呼吸系统和心血管系统的影响较小,在药效学有效剂量范围内安全性较高。
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【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R284;R285

【参考文献】