朊病毒病又称传播性海绵状脑病(TSEs),是一类罕见的致死性神经退行性疾病。在人类中主要包括克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、库鲁病(Kuru)、家族型致死性失眠症(fatal familial insomnia, FFI)和吉斯特曼-施特劳斯综合征(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome, GSS)等,在动物中主要包括牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalopathy, BSE)和羊瘙痒病(Scrapie)等。朊病毒病的临床表现为进行性共济失调、震颤、认知障碍,最终导致死亡,其病理特征为中枢神经系统出现海绵状变性、淀粉样斑块、神经元丢失以及星形胶质细胞增生等。该病目前较普遍认同的机制为正常构象的朊蛋白(PrPc)错误折叠,转变为异常朊蛋白(PrPSc),产生神经毒性,在中枢神经系统中积累并最终导致神经元细胞死亡线粒体是真核细胞中有氧呼吸产生ATP的部位,是细胞代谢所需能量的主要来源。近年的研究发现,线粒体是一种具有高度动态变化的细胞器,存在持续的转运、分裂、融合和自噬的动态过程。线粒体通过不断分裂与融合保持其形态及分布的稳态。线粒体的分裂与融合主要受一系列线粒体动力学相关蛋白的调控,主要包括：动力相关蛋白1(Drp1),以及它的作用因子包括Fisl、Mff、MID49和MID51等：线粒体融合蛋白Mfnl、Mfn2以及视神经萎缩症蛋白(Opa1)等。这些蛋白通过调节线粒体的分裂与融合,在调控线粒体的形态与分布,维护线粒体正常功能的各个环节上发挥重要的作用。正常情况下,Drp1主要分布于胞浆内,线粒体分裂时,Drp1被募集到线粒体分裂处,在分裂点周围形成环状螺旋,水解GTP释放能量,微管环收缩而切断线粒体。Opal位于线粒体内膜上,具有促进线粒体融合的功能,对维持嵴的形态具有重要作用。研究表明,在多种神经退行性疾病中都存在线粒体分裂融合的异常。除了表达水平的改变,蛋白质翻译后修饰对其发挥生物活性亦有重要的意义。研究发现蛋白巯基亚硝基化改变发生于多种神经退行性疾病中。最近研究发现Drp1蛋白存在多种翻译后修饰形式,如磷酸化、泛素化、亚泛素化、亚硝基化等。有研究表明在阿尔兹海默症(Alzheimer disease, AD)中,Drp1的总含量下降,但亚硝基化Drp1含量显著上升。然而,Drp1亚硝基化与朊病毒病中神经元损伤的关系及其机制尚不清楚。为探究线粒体动力学相关蛋白在朊病毒感染动物脑组织中表达及分布的变化,本研究针对Drp1和Opal两个蛋白,通过免疫印迹(Western blot, WB)及免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)方法分析其在中枢神经系统中的表达、分布；应用免疫荧光技术(Immunofluorescent assay, IFA)分析其在神经元细胞及星形胶质细胞中的定位情况。免疫印迹实验结果显示：在羊瘙痒因子139A感染终末期小鼠与C57正常小鼠脑组织,263K感染终末期仓鼠与正常仓鼠,利用羊瘙痒因子chandler株感染的SMB-S15细胞和经戊聚糖硫酸酯治疗后恢复的SMB-PS细胞裂解液经颅内注射的小鼠相比,Drp1含量均呈降低趋势,而ME7感染终末期小鼠与C57正常小鼠脑组织相比未发现明显变化；感染不同时间点脑组织中Drp1含量呈降低趋势,在中期达到最低,在终末期稍有回升；在ME7感染不同时间点小鼠脑组织中Drp1含量也呈先降低后升高趋势。免疫组化结果显示139A与ME7感染终末期小鼠大脑皮层与小脑中,Drp1表达量均降低。羊瘙痒因子不同毒株感染终末期实验动物脑组织与正常对照相比,Opa1含量均呈降低趋势,且在感染不同时间点,Opa1含量的降低呈时间依赖性。免疫组化结果显示在139A与ME7感染终末期小鼠大脑皮层与小脑中,Opa1表达量均降低。组织免疫荧光结果提示Drp1和Opa1在中枢神经系统中主要分布在神经元细胞。本研究提取了139A与ME7毒株感染小鼠不同时间点的亚硝基化蛋白,免疫印迹实验结果显示,较C57正常小鼠脑组织,139A和ME7感染的小鼠脑组织中亚硝基化的Drpl (SNO-Drpl)的含量明显升高。139A感染不同时间点小鼠脑组织中SNO-Drpl含量在感染90天时已有明显升高,在120天时达到最高,然后逐渐降低,180天时仍高于正常水平。然而在两种毒株感染的小鼠脑组织中,均未检测到亚硝基化形式的Opa1蛋白。本研究结果表明在朊病毒感染的动物模型中,线粒体动力学相关蛋白的表达及其亚硝基化修饰水平出现了改变,而这些蛋白含量及亚硝基化修饰含量的改变可能与线粒体形态、分布及功能障碍直接相关。这些结果提示,朊病毒病感染的动物脑组织内存在线粒体动力学的异常,而线粒体线粒体分裂融合平衡紊乱可能是朊病毒病线粒体改变的过程中的一个重要环节,导致中枢神经系统中神经细胞不可逆的损伤,最终导致朊病毒病的发生。
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.9
文章目录
摘要
Abstract
引言
实验材料与方法
结果
讨论
小结
参考文献
综述；线粒体功能异常与朊病毒病的关系
综述参考文献
缩略词对照表
个人简历
致谢
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