二甲基亚砜（DMSO）增强细胞膜穿透肽TAT穿膜效率的实验研究

发布时间：2021-06-28 16:02

目的: TAT是最早被发现并被用于在体外和体内向胞内运送蛋白分子的细胞膜穿透肽,研究发现,其穿膜效率并不理想,亟需探索更佳穿膜条件以提高TAT穿膜效率。以二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)预处理体外培养的多种细胞,观察TAT穿膜效率的变化,以期优化TAT穿膜条件,为其推广应用提供实验基础。方法:1)化学合成荧光标记短肽TAT-FITC和NCO-FITC,DMSO预处理Caski、Siha、HepG2、A549、COS7细胞株后观察TAT的穿膜情况,通过荧光显微镜下观察或荧光定量,优化TAT的穿膜条件。2)通过红细胞裂解实验和乳酸脱氢酶释放实验评价DMSO处理红细胞及各细胞株后细胞膜的完整性,MTT检测DMSO预处理对各种细胞株细胞活力的影响,荧光定量检测DMSO预处理细胞是否改变TAT的穿膜方式。3)构建GFP、Apoptin、TAT-GFP、TAT-Apoptin原核表达质粒。经PCR、双酶切及序列分析重组原核表达质粒构建的正确性;用重组质粒转化E. coli BL21(DE3)经IPTG诱导表达后通过Ni-NTA亲和层析纯化蛋白GFP、Apoptin、TAT-GFP和TAT-Apoptin,Western blot法鉴定融合蛋白表达的正确性。4)荧光显微镜下观察DMSO预处理Caski细胞后融合蛋白TAT-GFP的穿膜效率,TUNEL法检测DMSO预处理Caski细胞后融合蛋白TAT-Apoptin发挥诱导细胞凋亡的生物学活性。结果:1) 10% DMSO预处理各细胞株后TAT穿膜效率明显增强,胞内荧光分布均匀,胞核较胞浆浓集,NCO对照组胞内未见荧光分布;血清的存在降低DMSO对TAT穿膜效应的增强作用。2) DMSO不影响红细胞及多种细胞株的细胞膜完整性;不同细胞对DMSO处理2小时后各细胞株活力影响均较小且不同细胞株对其敏感程度不同;DMSO预处理细胞后不改变TAT的穿膜方式。3)经PCR、双酶切及DNA测序确定成功构建出GFP、Apoptin、TAT-GFP、TAT-Apoptin的原核表达质粒;诱导表达并纯化制备出蛋白;Western blot法检测融合蛋白表达质粒在E. coli BL21(DE3)中正确表达。4)荧光显微镜下观察发现Caski细胞在经10% DMSO预处理后TAT-GFP融合蛋白能高效穿膜并在胞内均匀分布;通过TUNEL检测DMSO预处理增强了TAT-Apoptin融合蛋白进入细胞并发挥诱导Caski细胞凋亡的生物学活性。结论:1) 10%的DMSO预处理可以增强TAT-FITC的穿膜效率并使其在胞内均匀分布;2) DMSO预处理细胞后并不影响细胞膜的完整性,对细胞活力影响较小;3) DMSO预处理细胞后并不改变TAT的穿膜机制;4) DMSO预处理细胞后可增强TAT-GFP蛋白的穿膜效应和TAT-Apoptin介导的诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性。
【学位授予单位】：三峡大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R363

文章目录

中文摘要

Abstract

英文缩写一览表

引言

1 DMSO 对TAT-FITC 穿膜效率的影响及其条件优化

1.1 材料与方法

1.2 结果与分析

2 DMSO 对细胞膜结构、细胞活力及对TAT 穿膜机制的影响

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

3 TAT-GFP、TAT-Apoptin 原核表达及蛋白纯化

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

4 DMSO 增强TAT-GFP、TAT-Apoptin 融合蛋白的穿膜效应

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

5 讨论

6 总结

参考文献

综述

参考文献

致谢

附录:攻读硕士学位期间发表的部分学术论

【共引文献】