微米拓扑结构的构建及其用于骨和软骨修复的研究

发布时间：2018-04-26 13:52

本文选题：微米拓扑结构 + 生物微加工　；参考：《华南理工大学》2015年博士论文

【摘要】：在体内,细胞所处的微环境对其增殖、分化等有着重要的调控作用。随着分子生物学、再生医学等学科的发展,人们意识到材料表面性质如亲疏水性、化学组成、表面拓扑结构等对细胞有很重要的影响。微纳米拓扑结构作为体内体外对细胞行为影响的重要因素,研究其对细胞行为的影响规律,揭示其内在机理,对胚胎发育、组织修复、组织工程及再生医学等学科的发展均有重要意义。得益于微加工技术的发展,近几年人们研究了各种微纳米拓扑结构对细胞的影响,并取得了诸多成果,加深了人们对细胞与其生长微环境相互作用的理解,也为体外组织构建和医学植入体材料的表面处理提供了理论依据。纳米级拓扑结构能与细胞表面分子直接作用,从而影响细胞的命运;亚微米拓扑结构能与细胞器相互作用,影响细胞的形态,从而影响细胞的命运;微米级拓扑结构能影响细胞群的组织、迁移,从而影响组织形态的发生、损伤的修复。目前大量研究主要集中在纳米及亚微米结构对细胞行为的影响,而微米拓扑结构对细胞的影响则较少被关注。微米拓扑结构作为组织中不同于纳米和亚微米的第三级结构,对骨和软骨修复最终宏观结构的形成和功能的实现极为重要。密质骨和关节软骨均为多级有序结构,这种多级有序结构为实现其功能有着举足轻重的作用。但是,目前关于骨和软骨修复的研究,主要表征和关注骨和软骨相关基因的表达及蛋白的分泌,但是对它们的组织形式和结构予以很少研究和关注。本研究希望通过研究各种尺寸和形状的微米拓扑结构对细胞群分布、迁移、分化及聚集的影响,从而构建一种具有多种形状的微米组合拓扑结构的表面。一方面,该拓扑结构表面能引导细胞定向迁移募集,从而实现促骨缺损愈合,及骨和软骨一体化修复。另一方面,该拓扑结构表面所具有的多种形状的微米级拓扑结构能于不同位置促进细胞向成骨或成软骨分化,引导细胞在微米尺寸的排列,从而使其所分泌的细胞外基质与天然骨或软骨相似,以更好地实现组织修复、功能重建。在众多的拓扑结构制备方法中,我们选用软光刻在生物材料表面制备微米级的拓扑结构。为了获得较深的拓扑结构,我们选用Fururrex公司的负性厚光刻胶。厚光刻胶由于其高达几百微米的厚度,其光刻工艺和薄光刻胶的光刻工艺有较大差异。且各实验室条件不同,光刻工艺也略有差异。我们根据该光刻胶的特性,结合本实验具体情况,对光刻工艺参数进行优化。在此基础上,结合软光刻的几种成型工艺,我们成功地在聚己内酯(pcl)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、壳聚糖(cs)、生物玻璃(bg)表面制备了各种形状、不同尺寸的微米拓扑结构,并成功构建了bg/pcl复合图案化表面。间充质干细胞(hmscs)在骨和软骨修复研究中广为关注。在我们的研究中,hmscs在微米沟槽表面表现出除了“接触诱导”外更为复杂的行为。我们首次观察到了hmscs悬空横跨在宽达100μm的沟槽上的现象。hmscs的这种“架桥”行为对组织修复是有利还是有弊?为此我们对该现象做了系统深入的研究。实验结果表明,hmscs在沟槽底部,通过攀住沟槽的侧壁而实现这种“架桥”行为。hmscs只在宽深比2的沟槽上形成“架桥”。微丝及细胞核染色表明,架桥的hmscs微丝发生解聚并在边缘形成“肌动蛋白边缘束”,细胞核也发生明显的畸变。afm对细胞弹性模量的测试表明,架桥细胞的弹性模量和对照组比没有差异。骨钙蛋白染色、alp及茜素红染色表明,架桥的hmscs并没有向成骨分化。结蛋白的染色结果表明,部分架桥的hmscs提高了结蛋白的表达,特别是被拉伸得又长又细的细胞。此外,这种“架桥”行为并非hmscs特有,atdc5(小鼠畸胎瘤细胞)、mg-63(人骨肉瘤细胞)和c2c12(小鼠成肌细胞)均能在沟槽上实现“架桥”行为,但它们彼此之间也略有差异。为了研究拓扑结构促骨愈合及引导干细胞向软骨损伤部位募集的能力,我们采用体外划痕实验来研究沟槽拓扑结构对细胞定向生长的影响。微米拓扑结构能极大地促进mg-63细胞平行于沟槽方向生长,却抑制mg-63细胞垂直于沟槽方向生长。进一步的研究表明,沟槽宽度对mg-63细胞平行于沟槽方向生长的速度没有影响,但沟槽深度对mg-63细胞平行于沟槽方向的生长速度有很大影响:沟槽越浅,越有利于细胞平行于沟槽方向生长。沟槽促进或抑制细胞平行或垂直于沟槽方向生长是通过促进或抑制细胞群体平行或垂直沟槽方向来的迁移实现的。在沟槽边缘的细胞首先发生极化,出现“接触诱导”现象,随着细胞的增殖,这种极化性质通过细胞间的相互接触被传递到整个细胞群,使细胞群发生群体极化并向着平行于沟槽方向迁移。此外,沟槽结构还能促进hmscs、c2c12细胞平行于沟槽方向生长,但不能促进atdc5细胞平行于沟槽方向生长。最后,我们研究了微米级拓扑结构对细胞成骨和成软骨分化的影响。hmscs在d25w200的pcl沟槽结构表面的成骨分化表明:微米级沟槽结构相比于对照组,虽不能促进hmscs的成骨分化,但能调节细胞群体的组织排列,从而调节了Ⅰ型胶原和钙盐沉积的组织方式,使它们呈现出与天然骨基质类似的取向性结构。bg/pcl复合图案化表面能影响hMSCs的铺展、形态和分布,但并没有促进其向成骨分化。PMMA表面微米级凹坑结构能促进ATDC5在凹坑内的聚集,且能促进其Ⅰ型胶原和糖胺聚糖基因的表达,及软骨特征基质的分泌。综上,适当尺寸的沟槽结构和凹坑结构的结合,能促进骨愈合、引导干细胞到软骨缺损部位募集,且能引导细胞分泌骨或软骨特征基质,并调节它们组织成为与天然骨或软骨组织类似的结构,在实现骨/软骨一体化修复方面具有极大的潜在价值。
[Abstract]:In recent years , it is important to study the effect of micro - nano - topological structure on cell population distribution , migration , differentiation and aggregation . On the basis of the characteristics of the photoresist , we optimize the parameters of photoetching process according to the characteristics of the photoresist . On the basis of this , we have made a systematic study on this phenomenon . In order to study the effect of the structure of the groove on the growth of the cells in the direction of the groove , the effect of the structure of the groove on the growth of the cells in parallel or perpendicular to the groove was studied .

【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08;R687

【共引文献】