PDK1基因敲除小鼠中与心衰相关的长链非编码RNA（Lnc RNA）的筛选
既往的研究已经表明,长链非编码RNA (LncRNA)参与人类许多疾病的发生和发展,如癌症、HELLP综合征和短指综合征。然而,LncRNA在心力衰竭(HF)中的研究报道较少。因此,我们研究了PDK1基因心肌特异性敲除(KO)小鼠心力衰竭模型的心脏组织中LncRNA的表达谱变化。我们分别取出生后第8天(P8)和第40天(P40)的PDK1基因敲除(KO)和野生型(WT)小鼠的心脏标本,通过Arraystar LncRNA基因芯片进行LncRNA表达谱的分析筛选。KO组和WT组芯片的结果表明：在P8,表达水平变化大于1.5倍的有2024个LncRNA,而在P40,表达水平变化大于2倍的有4059个LncRNA。我们应用实时定量PCR (RT-PCR)验证了随机选择的19个LncRNAs基因表达水平的变化。同时生物信息学分析表明：mkk7,一个顺义重叠LncRNA,可能通过MAPK信号传导途径参与到心力衰竭的病理过程中。我们推测这些差异表达的LncRNA可能参与了PDK1基因心肌特异敲除小鼠心衰过程的发生发展。 第一部分PDK1基因敲除小鼠心衰时心脏组织中LncRNA的筛选 目的：了解PDK1基因敲除小鼠心衰时心脏组织中LncRNA表达水平是否发生变化。 方法：剪小鼠尾巴裂解,抽提DNA, PCR法鉴定心肌中特异敲除(KO)的小鼠,Western blot法验证PDK1蛋白敲除水平。取出生后40天PDK1基因KO和WT小鼠各三个心脏组织混合样本,送公司做Arraystar LncRNA芯片,通过生物信息学分析,筛选出可能跟心衰相关的LncRNA,应用RT-PCR验证筛选结果。 结果：1)一共有4059个LncRNAs表达水平变化大于2倍；2)其中,2094个LncRNAs上调,1965个LncRNAs下调；3)随机验证6个LncRNA的结果有统计学意义(P0.05)且与芯片结果一致。 结论：1)PDK1基因敲除小鼠心衰时心脏组织的LncRNA表达水平确实发生了变化。 第二部分PDK1基因稳定敲除小鼠心衰前心脏组织中LncRNA的筛选 目的：了解PDK1基因敲除小鼠心衰前心脏组织中LncRNA表达水平的变化。 方法：PDK1基因敲除小鼠鉴定同前；取心脏组织特异性敲除(KO)小鼠和同年龄野生型(WT)小鼠为研究对象,观察出生第6天、第8-9天小鼠心脏PDK1蛋白水平；PDK1蛋白水平稳定敲除后,称量心脏重量和体重,计算心脏重量指数(HW/BW);光镜下观察心脏的整体外观变化；组织切片观察心脏形态变化,超声心动图检测评估小鼠心脏功能变化。取PDK1基因KO和WT小鼠各三个心脏组织混合样本,送公司做Arraystar LncRNA芯片,通过生物信息学分析,筛选出可能跟心衰相关的LncRNA,应用RT-PCR验证筛选结果并与芯片结果比较。 结果：1)在出生第9天时,PDK1蛋白在心脏组织中稳定敲除；2)KO小鼠与WT小鼠的心脏重量指数有统计学意义；3)KO小鼠和WT小鼠的心脏外观无明显差异；4)KO小鼠和WT小鼠的心脏切片形态无明显差异；5)超声心动图检测发现KO小鼠的心脏功能也无明显变化；6)有2024个LncRNAs表达水平变化大于1.5倍；7)其中1224个LncRNAs变化上调,800个LncRNAs变化下调；8)随机验证的5个LncRNAs有统计学意义(P0.05)且与芯片结果一致。 结论：1)PDK1基因稳定敲除小鼠与野生型小鼠相比,心脏整体外观、心脏形态功能与WT小鼠比较均无明显差异；2)KO小鼠心脏体重指数具有统计学上显著性差异；3)虽然PDK1基因稳定敲除小鼠未发展为心衰状态,但心脏组织中LncRNA的表达水平确实发生了变化,并且部分通过RT-PCR得到了验证。 第三部分PDKl基因敲除小鼠心衰前与心衰时心脏组织中LncRNA的对比筛选及其相关机制的研究 目的：筛选出PDKl基因敲除小鼠在心衰发展过程中的变化的LncRNA,同时探讨LncRNA在心衰发展过程中可能的作用机制。 方法：以第一、二部分芯片结果为基础,进行对比筛选,并且通过RT-PCR验证筛选出的LncRNA的表达水平变化。后通过LncRNA的靶标mRNA的GO和Pathway的生物信息学分析来探讨可能的作用机制。 结果：对比筛选的结果如下：1)在两个时间点上同时上调的有93个LncRNAs;2)在两个时间点上同时下调的有52个LncRNAs;3)先在P8天上调后在P40天下调的有136个LncRNAs;4)先在P8天下调后在P40天上调的有51个LncRNAs;5)随机验证了8个LncRNAs均有统计学差异(P0.05)且与芯片结果一致。生物信息学分析的结果如下：1)在P8天,有9个与心脏功能相关的信号通路发生了变化,其中包括MAPKsignaling、Cell adhesion molecules和Calcium signaling pathway (P0.05);2)在P40天,有10个影响心脏功能的信号通路发生了变化,其中包括MAPK和Cell adhesion molecules Pathway (P0.05);3)筛选发现一条顺义重叠的LncRNA(mkk7),分析发现可能通过MAPK信号通路参与心衰的病理过程。 结论：1)PDKl基因敲除小鼠在两个时间点上即心衰发生前后,LncRNA表达水平发生多种情况的变化,推测可能参与了心衰的发生发展；2)在心衰的发生发展的过程中, LncRNA的靶标mRNA参与的信号通路发生变化；3)mkk7可能通过MAPK信号通路参与心衰的发生发展。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R541.6
【目录】：
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