col4a3基因敲除对视网膜的影响

发布时间：2020-05-28 18:00

【摘要】：目的:Alport综合征是一种以进行性肾功能衰竭、感音神经性耳聋以及眼部异常为特征的遗传性疾病。col4a3基因敲除鼠是Alport综合征的疾病模型,已在肾、耳部得到认证,但是眼部却鲜有研究。本次试验将通过免疫组化实验检测野生型小鼠与col4a3基因敲除鼠视网膜基底膜(Bruch's membrane)部IV型胶原蛋白α链的分布、以及其他相关成分的分布情况,对比两种小鼠的异同;以及通过电子显微镜及组织学技术来验证col4a3基因敲除鼠的视网膜Bruch's membrane是否有异常表现,检测col4a3基因敲除鼠视网膜色素上皮细胞层和视细胞是否存在损害,以此来初步推测col4a3基因敲除鼠是否能成为Alport综合征眼部视网膜病变的动物模型。研究方法:1.通过免疫组化实验检测野生型小鼠与col4a3基因敲除鼠视网膜基底膜(Bruch's membrane)部IV型胶原蛋白α链分布、以其他相关成分的分布情况,对比两种小鼠IV型胶原蛋白α链以及其他相关组成成分的异同。2.通过透射电子显微镜及组织学技术对比观察col4a3基因敲除鼠与野生型小鼠,来检验col4a3基因敲除鼠的视网膜Bruch's membrane是否有异常表现,同时检测col4a3基因敲除鼠视网膜色素上皮细胞层和视细胞是否存在损害。结果:1.免疫组化实验结果显示,在野生型小鼠视网膜基底膜(Bruch's Membrane)中可表达α1(IV)、α2(IV)、α3(IV)、α4(IV)、α5(IV)IV型胶原蛋白链的分布,且信号较强;而col4a3基因敲除鼠视网膜基底膜(Bruch's Membrane)中仅表达α1(IV)与α2(IV)IV型胶原蛋白链的分布,且信号明显减弱。2.透射电子显微镜检测发现,与野生型小鼠相比,col4a3基因敲除鼠的Bruch's Membrane明显变薄、RPE细胞之间连接松散、微绒毛结构明显改变、基底皱褶部分消失。3.组织学技术(HE染色)结果发现,与野生型小鼠相比,col4a3基因敲除鼠的RPE层明显变薄(P0.001)。4.免疫组化实验结果显示:(1)与野生型小鼠相比,col4a3基因敲除鼠RPE65信号明显改变:RPE色素颗粒分布不均匀且色素颗粒数量明显减少;(2)与野生型小鼠相比,col4a3基因敲除鼠Ezrin信号在RPE层微绒毛结构处明显改变;(3)与野生型小鼠相比,col4a3基因敲除鼠GFAP信号在视网膜内界层到外界层之间明显增强;(4)与野生型小鼠相比,col4a3基因敲除鼠Fibronectin信号在RPE层稍有增强;(5)与野生型小鼠相比,col4a3基因敲除鼠Laminin5信号在Bruch's Membrane处稍有减弱;(6)与野生型小鼠相比,col4a3基因敲除鼠Albumin信号明显改变,充斥RPE全层且信号增强。结论:col4a3基因敲除确实会在小鼠视网膜产生病变,初步认为col4a3基因敲除鼠可以作为Alport综合征眼部视网膜病变的动物模型。
【图文】：

基因敲除,方案分析,眼部,基因型

道： 1 2 3 4 5 6 7 81 采用 PCR 鉴定方案分析 col4a3 基因敲除鼠的验检测小鼠眼部视网膜基底膜区Ⅳ型型胶原蛋白 α 链在两种小鼠眼部视网膜基在荧光显微镜下进行观察。实验重复 3 次（对照组）眼部视网膜基底膜区可见 α1~强；α6 链不可见；眼部视网膜 RPE 层血；col4a3 基因敲除鼠（实验组）眼部视网的分布，，但信号明显减弱；α3、α4、α5、区可见 α1~α2 链的分布，其余均不可见。

分布情况,眼部,视网膜,α链

图 2 IV 型胶原蛋白 α 链在野生型小鼠眼部视网膜基底膜区（对照组）的分布情况（×44）注：健康成年（6 月龄）野生型小鼠眼部新鲜冰冻切片分别由 α1（IV）（A）、α2（IV）（B）α3（IV）（C）、α4（IV）（D）、α5（IV）（E）以及 α6（F）抗体进行标记。实心单箭头所示Bruch's 基底膜处的信号，空心单箭头所示为血管处信号。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R774.1

【参考文献】