三氯生暴露通过自噬致雄性生殖损伤的机制研究

发布时间：2020-08-19 18:51

【摘要】：研究背景不孕不育是社会广泛关注的公共卫生问题,大约影响了全世界8-12%的育龄夫妇,并且有40-50%可能是由于“男性因素”造成的不育,其中精子数量和质量降低是男性不育最主要的原因。研究表明,许多环境内分泌干扰物(EEDs)都能造成人和动物的生殖系统损伤,并降低男(雄)性的精子质量。三氯生(TCS)是一种广泛用于个人洗护用品和临床消毒的酚类广谱抗菌剂,被认为是潜在的EEDs。精子的产生是一个高度有序的过程,依赖于睾丸生殖细胞增殖、分化和死亡之间的平衡调节,自噬是不同于凋亡的一种细胞死亡形式,适度的自噬能促进精子的分化和成熟,保护生精细胞免受有害条件的侵害,超过细胞承受能力的自噬将诱导细胞Ⅱ型程序性死亡。本课题组选取10对精液质量异常的病例组和正常对照组的精液样本,通过自噬功能基因芯片和相关文献报道,筛选出可能与TCS相关并导致精液质量降低的CXCR4、ESR1、PTEN和LC3B四个自噬基因,目前,TCS是否通过细胞自噬导致生殖损伤尚未见报道,本文旨在探讨TCS暴露通过自噬基因的调控作用导致生殖损伤的可能机制。材料与方法第一部分:自噬基因的筛选及人群验证。研究对象选自2016年6月至2017年9月期间在深圳市某三甲医院生殖中心进行精液检查的男性,收集其精液样本、精液常规结果和问卷信息。方法:1.选取精液质量异常和和精液质量正常的受试对象各10例,进行精液自噬基因芯片检测,并结合文献报道与EEDs作用机制相关的基因,筛选出可能与TCS相关并导致精液质量降低的自噬基因。2.采用成组设计的病例对照的研究方法,选取精液质量异常的病例104例,精液质量正常的对照250例,采用Trizol法提取精液总RNA,逆转录成cDNA,qPCR的对上述差异表达基因进行验证。第二部分:TCS经口暴露的动物实验。用TCS对8周龄的SD大鼠进行经口暴露染毒,以未观察到有害作用水平(NOAEL=50mg/kg/d)为中等暴露剂量,设计暴露剂量梯队。在空白组、玉米油溶剂对照组(1Omg/kg)、低剂量组(10mg/kg)、中剂量组(50mg/kg)和高剂量组(250mg/kg)五个实验组中,观察睾丸组织损伤和相关自噬基因的表达。方法:3.用HE染色,透射电镜方法观察睾丸组织的病理损伤。4.用免疫组织化学、qPCR和蛋白印迹技术对筛选的自噬相关基因进行检测。结果1.自噬基因芯片筛选中,与对照组相比,在84个自噬相关功能基因中,有18个自噬基因表达差异倍数大于2且全部表达下调,结合文献报道,最终筛选出CXCR4、ESR1、PTEN和LC3B四个可能与TCS相关并导致精液质量降低的自噬基因。2.在人群验证中,相对于对照组,ESR1基因在病例组表达显著下降(P0.05),CXCR4、PTEN和LC3B在病例组均有下降趋势,但无统计学意义。3.TCS暴露组中,HE染色结果显示:睾丸曲细精管发生损伤,出现空泡样改变,精子减少,各剂量组具有剂量-反应关系。透射电镜同样发现了 HE染色显示的组织损伤,同时发现成熟的自噬溶酶体结构、线粒体和高尔基体出现肿胀和空泡。4.免疫组化结果显示,LC3B在空白组和溶剂对照组中,只有少量浅黄色颗粒,而在低、中和高剂量组中呈现大量棕黄色颗粒,并随着剂量增加远离曲细精管管腔分布。CXCR4,ESR1和PTEN在各组间没有差异;与对照组相比,qPCR结果显示LC3B基因表达在病例组中表达升高,差异具有统计学意义(p0.05);蛋白印迹结果显示,LC3B-Ⅱ蛋白和LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白比值在低剂量组和中剂量组表达升高,差异具有统计学意义(p0.05)。结论1.自噬相关基因ESR1在人群精液中的低表达,可能与精液质量降低有关。2.TCS暴露导致大鼠睾丸曲细精管损伤,生精细胞脱落和减少,表明TCS具有一定的生殖毒性。3.TCS暴露使雄性大鼠睾丸组织LC3B基因mRNA水平、LC3B-Ⅱ蛋白和LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白比值升高,提示自噬可能参与了TCS致大鼠睾丸组织损伤的过程。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114
【图文】：

结构式

大部分人都处于广泛而长期的ＴＣＳ暴露之中ｔ１９，２Ｇ］。逡逑ＴＣＳ的芳香特性和高氯含量使其能够抵抗降解并在环境中持续存在（ＴＣＳ逡逑结构见图１－１），一方面，ＴＣＳ在地表水，土壤，沉积物和水生物种中都有检测逡逑到［２１］。在美国，高达５７．６％的溪流和河流中均能检测到ＴＣＳ，ＴＣＳ被列为美国河逡逑流中能检测到的前１０名的污染物［２２￣２３］；在新加坡，城市集水区ＴＣＳ检测率为逡逑１００％邋（最高浓度为６１ｎｇ／Ｌ），覆盖了新加坡约六分之一的陆地面积［２４］；在巴逡逑西圣保罗的河流中，１＾：５的检测浓度为２．２－６６１１＆／１；２５］；在中国珠江水系的地表逡逑水和沉积物中，ＴＣＳ的浓度分别为１１－４７８叩／１＾和５０－１３３0１＾４￥气同时，也逡逑有证据表明，由于受到污染的废水或肥料的影响，农业食物的供应也可能受到了逡逑ＴＣＳ的污染另一方面，ＴＣＳ在人体各种体液和组织样本中都有检出，包括逡逑尿液、血液

自噬,现象,溶酶体

逑嗤主要包括巨自嗤（Ｍａｃｒｏａｕｔｏｐａｈｇｙ）、微自嗟（Ｍｉｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ）和分子伴侣介导逡逑的自嗤（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄａｕｔｏｐｈａｇｙ，ＣＭＡ）三种形式，见图１－２。我们通常说逡逑的自噬指的是“巨自噬”，也是自噬领域目前研究最多的一种形式，主要针对于逡逑可溶性大分子物质和受损细胞器的降解。在自噬过程中，细胞首先形成双层或多逡逑层膜结构的吞噬泡（Ｐｈａｇｏｐｈｏｒｅ），吞噬泡一般来源于细胞内的内质网和线粒体逡逑膜结构；吞嗤泡包裹着待降解的细胞质或者细胞器形成自嚼体（Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ）；逡逑随后自嗤体和溶酶体发生融合，形成自嗤溶酶体（Ａｕｔｏｐｈａｇｏｌｙｓｏｓｏｍｅ），最后，逡逑溶酶体通过各类水解酶将自噬溶酶体中包裹的物质降解，促进细胞更新代谢。微逡逑自噬和分子伴侣介导的自噬主要针对于小分子可溶性物质的降解，微自噬主要逡逑通过溶酶体膜自身内陷包裹待降解物质，在溶酶体内完成自噬降解，整个过程没逡逑有自噬体的形成；ＣＭＡ是一种非常复杂和特异的途径

曲细精管,生精细胞,雄性大鼠,星号

３．２结果逡逑３．２．１邋ＴＣＳ染毒大鼠睾丸组织ＨＥ染色结果逡逑如图３－１所示，ＴＣＳ暴露后大鼠睾丸曲细精管ＨＥ染色结果。其中，空白组逡逑（Ｂｌａｎｋ）和对照组（Ｃｏｎｔｒｏｌ）都能够观察到正常的睾丸结构和完整的曲细精管，逡逑包括最外层的精原细胞和支持细胞，中间层的精母细胞，最内层的精子细胞及精逡逑子，并且各级生精细胞和支持细胞排列紧密。逡逑３７逡逑

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