金丝桃苷对脂多糖所致小鼠急性肾损伤的保护作用及其机制研究

发布时间：2020-03-18 20:37

【摘要】：研究背景急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是一种严重临床病症,在急症病例中大约有1/5的病人会罹患这一疾病。在住院病人中急性肾损伤成为普遍而且危险的加速患者死亡的因素,它可以由药物毒性及脓毒症所引起。脓毒症合并AKI预示着一个可怕的临床情况,其相关的医院死亡率可高达70%。多年来,脓毒症引起的器官损伤和其他有害并发症被认为是由一种过度炎症反应诱发的细胞因子风暴所致,它因感染性病原体或生理性应激而触发。多个利用大鼠离体和在体实验研究表明,通过血虑广泛吸附减少炎性细胞因子可以防止肾和肝损伤,提高细菌清除率和平均动脉压,降低细胞凋亡和肾小管细胞损伤,并提高总体生存率。有大量研究聚焦于明确哪些是与常见脓毒症综合征相关的特异性细胞因子。尽管进行了大量研究,但脓毒症和AKI临床表现之间基本的病理生理机制关系还没有完全清楚。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁外层成分,有研究证明它是导致脓毒症急性肾损伤的主要诱发因素。LPS诱导的脓毒症有多种炎性因子参与介导。在小鼠中LPS引起导致急性肾损伤的细胞炎性因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白介素6(interleukin-6,IL-6)和白介素1β(Interleukin 1 beta,IL-1β)在急性肾损伤的病理改变进程中扮演了重要角色。NF-κ B是一种高度表达的转录因子,常在细胞应激反应中被激活,诱导肿瘤坏死因子-α、IL-1、IL-6和IL-8的合成和释放。虽然从肾脏局部产生炎症因子对全身的细胞因子水平的总体贡献是未知的,但由核因子-κκB(nucler factor-κκB,NF-κκB)介导的信号转导过程确实可在分离的原代大鼠肾小管上皮细胞发生。Toll样受体-4(Toll-like receptors 4,TLR-4)在移植肾缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury,IRI)的发病机制中起着重要作用。TLR-4不仅对外源微生物基序有反应,而且能识别应激和坏死细胞释放的相关分子,同时能识别内源性大分子的降解产物。在肾缺血再灌注损伤过程中,TLR-4的上调见于肾小管上皮细胞、血管内皮细胞,这是由内源性损伤相关分子模式(如高迁移率组合染色体蛋白1)的大量酶诱导的。TLR-4的激活促进炎症介质的释放,促进白细胞迁移和浸润,激活先天和获得性免疫系统,并增强肾纤维化,在临床上常常导致严重的不良后果,而抑制这些炎症因子可以减轻肾组织的损伤程度。有研究者对TLR-4基因敲除小鼠,移植能够表达TLR-4的异体肾的实验表明,相对于局部TLR-4整体的表达合成可能更为重要。NF-κ B直接抑制药物如methyl-2-acetamidoacrylate(一种丙酮酸乙酯类似物,丙酮酸乙酯和烟碱型乙酰胆碱)能降低小鼠血清细胞因子(TNF-α、IL-6、IFN-γ和IL-10γ),改善已有感染症状AKI小鼠的临床特征,减轻肾功能损伤的程度。因此早期采取针对性抗炎治疗可以有效改善肾功能。NOD样受体蛋3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)隶属于模式识别受体PRR(patern recognition receptor,PRR)这一大类蛋白受体家族,它是其中一个亚家族的成员,接头蛋白可以与活化的Nod样受体蛋白产生相互作用,进而激活半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1),形成一种称为“炎症小体(inflammasome)”的蛋白复合物,作为免疫防御的第一步识别感染并启动病原体清除和组织修复过程。炎症小体是参与这些过程的最重要的复合物之一它通过ASC(包含一个分子衔接的凋亡相关微粒蛋白,apoptosis-associated speck-like protein containing,CARD)招募pro-caspase-1,然后将细胞因子前体pro-IL-1 β和pro-IL-18切割成成熟的IL-1β和IL-18。活化后的炎症小体还通过调节Gasdermin D(GSDMD)的N端区域在细胞膜中形成孔道,促进称为细胞焦亡的一种“炎性形式”的细胞死亡。存在于肾脏内的单核网状吞噬细胞可以为IL-1 β、IL-18产生以及NLRP3的合成提供必要的物质条件,有研究显示NLRP3基因敲除的小鼠与野生型小鼠相比,在慢性肾损伤时IL-1β、IL-18和Caspase-1蛋白的含量降低,肾小管的损伤减轻。多位学者的多项研究发现,在糖尿病相关肾损伤中NLRP3炎性小体及NF-κB的表达升高,NLRP3-Caspase-1-IL-1 β/IL-18这一通路在此现象中有重要作用。总之,TNF-α,IL-1β,IL-6,NLRP3,TLR-4等物质在急性肾损伤发生中扮演了重要的角色。传统中草药是研究开发新型药物的重要资源,在这一问题上众所周知的青蒿素、紫杉醇等的发现就是一强有力的证明。金丝桃苷是一种黄酮类化合物来源于杜鹃花科、卫矛科和藤黄科植物,它对哺乳动物表现有多种生物学效应,如抗炎作用便是其中之一,有报道它能抑制LPS导致的大鼠腹膜巨噬细胞的亚硝酸盐生成,也能抑制LβS导致的小鼠急性肝损伤,在Sahreen S等人的研究表明金丝桃苷通过抗氧化应激、抑制炎症因子生成保护CC14(carbon tetrachloride)诱导的急性肝损伤。金丝桃苷还被发现有对心脏缺血再灌注损伤的保护作用。Lee S等用金丝桃苷作为工具药研究了p44/p42 MAPK(丝裂原活化蛋白激酶,mitogen-activated protein kinase)、p38 MAPK 和JNK(c-Jun氨基末端激酶,c-Jun N-terminal kinase)在大鼠腹腔巨噬细胞炎症反应中的作用发现,金丝桃苷可使p44/p42 MAPK、p38 MAPK和JNK表达抑制,进而降低 iNOS(Inhibitory nitric oxide synthase)表达,抑制NO合成,引起的结果是炎症反应的减轻。Kim SJ等在实验研究中发现金丝桃苷不但能够使NF-κ B的活化程度降低而且也可以减少I κ B-α的降解,从而说明金丝桃苷在机体的调节免疫调节活动中具有正面的作用。Hu J等实验发现中脑导水管周围灰质中的NR2B(N-methyl-D-aspartate Receptors 2B)和NMDA(N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate)受体可被金丝桃苷调节,由于这两个受体和炎症疼痛密切相关,而产生长时间消炎止痛效果。上述对NF-κκB、IL-1β、IL-18和Caspase-1等的研究,均侧重于肾缺血再灌注损伤的机理,而脓毒症所致的急性肾功能损伤也是临床遇到的难题之一,对于明确其发病机制,探索有效的防治方法也具有重要的临床意义。金丝桃苷具有肝脏、心脏等器官有保护作用,但其对LPS所致肾损伤是否也有保护作用尚不明确,因此在本实验中我们试图探究金丝桃苷对LPS所致脓毒症小鼠AKI是否也有保护效应,如果这种保护效应被证实,则进一步研究这种保护效应可能的机制。研究目的1研究金丝桃苷对LPS所致急性肾损伤小鼠TNF-α、IL-6和IL-1 β的影响。2研究金丝桃苷对LPS所致急性肾损伤小鼠血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酐的影响。3研究金丝桃苷对LPS所致急性肾损伤小鼠TLR4,NF-κ B和NLRP3表达的影响。研究方法1动物分组选择60只BABL/c雄性小鼠,6-8周龄,由滨州医学院实验动物中心提供。动物的使用符合医学动物实验伦理学要求。小鼠急性肾损伤模型的制备方法,小鼠腹腔进行注射15mg/kg的脂多糖,注射脂多糖后24小时采集小鼠血液,处死小鼠后摘取肾脏组织。60只BABL/c小鼠随机分为5组,每组各12只。组1作为阴性对照,只进行和实验药物同容量的PBS(磷酸缓冲盐溶液,phosphate buffer saline)液注射。组2作为LPS组,腹腔注射15mg/kg的LPS 50 u1,组3、组4、组5作为金丝桃苷+LPS组,组3给予金丝桃苷25mg/kg和LPS50 ul,组4给予金丝桃苷50mg/kg和LPS50 ul,组5予金丝桃苷100mg/kg和LPS50 ul,金丝桃苷在给予LPS后1h应用。2肾组织HE染色肾组织取材后,用含10%福尔马林的PBS液固定。固定好的肾组织修剪成大小合适的方块包埋于石蜡中。石蜡切片后(切片厚度为5微米)用H-E染色法染色,最后将制备好的肾组织切片放置于显微镜下观察形态学的变化。3血尿素氮和肌酐测定各组小鼠用上述相应的药物进行处理24小时后,收集每只小鼠的血液。使用自动分析仪分析测量本实验采集血清尿素氮和肌酐水平。操作方法根据设备的说明书进行。4酶联免疫吸附试验来自不同组的肾组织在冰上用PBS匀浆,然后在4℃以12000转/分钟,离心40分钟。随后,收集上清液,测定肿瘤坏死因子-α、IL-6和IL-1β的表达。根据厂家说明书,采用ELISA试剂盒检测炎性细胞因子水平。5 Western blot分析用蛋白提取液进行肾组织匀浆,以1OOOOg离心10分钟,用BCA蛋白试剂盒对上清液蛋白质浓度进行测定。在10%SDS-PAGE上蛋白质分离并转移到聚偏氟乙烯膜上,用5%无脂干奶粉阻断后,在4℃时将膜与原抗体孵育24小时。TBS/Tween20洗涤三次后,在室温下用HRP结合的二次抗体对膜探测lh。最后,用ECL化学发光试剂盒((ECL-plus,Thermo Scientific,USA)对膜进行可视化标记处理。6统计学分析数据以均数±标准差来表示,用单因素方差分析(Dunnetts t-test)和双尾T检验进行统计学分析析。检验标准以P0.05认为有统计学意义。结果1金丝桃苷对LPS导致的肾损伤病理形态学改变的影响为研究金丝桃苷的保护作用,我们用HE染色法检测对比正常肾组织和损伤肾组织的病理改变。对照组显示正常肾组织的形态学表现,在脂多糖组肾组织有严重的损伤表现,包括肾小管上皮细胞脱落,刷状缘微绒毛减少,肾单位的凋亡,而用金丝桃苷处理后无论肾小管上皮细胞脱落程度,还是刷状缘微绒毛减少的数量,以及肾单位的凋亡情况镜下观察均有明显改善。2金丝桃苷减轻AKI肾功能紊乱实验中以反映肾小球滤过损害程度经典可靠指标BUN和肌酐水平评估肾功能,和对照组相比,脂多糖组BUN和肌酐水平明显升高,而在用金丝桃苷处理后,这种由脂多糖导致的BUN和肌酐的升高可被金丝桃苷抑制,并且这种抑制有剂量依赖性(25,50,100 mg/kg)。3金丝桃苷抑制细胞因子的表达为研究金丝桃苷的抗炎效应,我们用ELISA法检测了炎性因子TNF-α,IL-6和IL-1 β的水平。和对照组相比,脂多糖组TNF-α,IL-6和IL-1 β的水平明显升高,而和脂多糖组相比较金丝桃苷处理组TNF-α,IL-6和IL-1 β的水平又明显减低。4金丝桃苷抑制脂多糖诱导的TLR4的表达和NF-κ B的活化TLR4是脂多糖诱导的急性肾损伤的一个重要因素,为了研究金丝桃苷的抗炎机制,我们考察了金丝桃苷对TLR4信号通路的影响。本实验结果表明脂多糖可显著上调TLR4的表达及激活NF-κ B,而金丝桃苷能显著抑制TLR4的表达,并且,金丝桃苷处理可剂量依赖的抑制NF-κB和IKBα的磷酸化。5金丝桃苷抑制脂多糖诱导的NLRP3信号通路为进一步研究金丝桃苷的抗炎机制,我们对金丝桃苷对NLRP3信号通路的影响进行了研究。结果和对照组相比,脂多糖组NLRP3,caspase-1和ASC的表达明显升高。而和脂多糖组相比金丝桃苷处理组NLRP3,caspase-1和ASC的表达受到明显抑制。结论在本实验条件下可得如下结论:①金丝桃苷对LPS所致的急性肾损伤有保护作用;②金丝桃苷的保护作用可能是通过抑制LPS导致的TNF-α,IL-6和IL-1β的合成,并且抑制LPS导致的TLR4表达和NF-κB的活化;③另外,金丝桃苷处理可剂量依赖的抑制NLRP3信号通路。总之,金丝桃苷可能通过抑制TLR4和NLRP3通路减轻LPS所致的急性肾损伤。
【图文】：

模式图,脓毒症,转录因子,模式图

逦山东大学博士学位论文逦逡逑（ＴＮＦ－ａ邋ａ、ＩＬ－６、ＩＦＮ－Ｙ和ＩＬ－１０邋丫）［２＿］，改善已有感染性ＡＫＩ的小鼠临床逡逑特征［１＿２］。逡逑如下示意图１标示了由肿瘤坏死因子－ａ，高迁移率（ＨＭＧ）邋Ｂ１，与多病菌所逡逑致脓毒症激活的ＮＦ－邋ｋ邋Ｂ转录因子途径。ＬＰＳ结合Ｔｏｌｌ样受体４邋（ＴＬＲ－４）是依赖逡逑于它与循环脂多糖结合蛋白ＬＢＰ和随后结合的膜ＣＤ１４邋［２３］。这种逡逑ＬＰＳ－ＬＢＰ－ＣＤ１４－ＴＬＲ－４复杂结构固定在各种细胞内（特别是在肾近端小管的顶端逡逑刷状缘），在那里启动细胞内信号转导通路。在人肾小管上皮细胞中脂多糖可上逡逑调ＣＤ１４基因表达［２４］［２５］，而在小鼠肾间质和管状上皮细胞是通过ＴＮＦ－ａ上调ＣＤ１４逡逑ＰｏｆｙｉｎｉｃｒｏｂＬａｌ逦—逡逑ｌＰＳ邋丨…一逡逑

示意图,分子过程,示意图

逦山东大学博士学位论文逦逡逑水平都显著反应性增加；３）通过树脂吸附法去滤除脓毒血浆炎症介质，这些效逡逑应信号和细胞凋亡水平可以减少［９：。事实上，在培养的肾小管上皮细胞暴露于严逡逑重烧伤和感染性ＡＫＩ患者血浆中时，可观察到细胞凋亡［５８：。逡逑所谓的死亡受体如Ｆａｓ、ＴＮＦ受体（ＴＮＦＲ１），或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导逡逑（ＴＲＡＩＬ）受体结合细胞外配体激活下游激活物半胱天冬酶［５４］。这个过程通常是逡逑通过ＦＡＤＤ（Ｆａｓ相关死亡结构域蛋白）受体介导，并最终激活效应分子ｃａｓｐａｓｅ－３。逡逑通过细胞应激产生在细胞内途径：活性氧（ＲＯＳ）、一氧化氮、ＡＴＰ减少、细胞／逡逑细胞基质扰动［＇５９］。在应对这些应激时，通过Ｂｃｌ－２家族的特异性的ＢＨ３蛋白活化，逡逑（＋）邋ＴＮＦ－ａ逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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